莜麦AnHRGP基因的生物信息学分析

材料与方法

AnHRGP基因序列如图1所示。通过NCBI-ORF、Protparam、SOMPA、Phyre2等在线分析网站（表1），预测分析AnHRGP基因的一级结构及理化性质、亚细胞定位、二级结构、超二级结构及三级结构等。本研究于2017年在山西大同大学生命科学学院实验室完成。具体分析方法：利用NCBI-ORF finder分析AnHRGP基因序列，并得到相应的蛋白质序列，应用Protparam工具分析AnHRGP的氨基酸组成及理化性质[6];利用SignalP 4.1 Server预测该蛋白质是否含有信号肽，进而确定其是否为分泌型蛋白[7];应用TMHMM Server v. 2.0对AnHRGP进行跨膜结构分析，若无跨膜螺旋结构且氨基酸序列总体在膜外则说明该蛋白质为非跨膜蛋白[8];利用PSORT对AnHRGP进行细胞内定位，測定该蛋白质在细胞中的分布[9];通过SOMPA在线预测程序对AnHRGP进行二级结构预测，并确定构成其二级结构的主要元件[10];运用PROSITE进行蛋白质功能位点分析;通过ExPASy COILS程序在线分析预测AnHRGP的卷曲螺旋域，以确定其是否具有卷曲螺旋域[11];通过CD search工具对蛋白质保守结构域进行预测;应用相应的蛋白质三级建模方法对蛋白质进行建模[12]。

2 结果与分析

2.1 AnHRGP的一级结构及理化性质分析

通过NCBI-ORF finder分析AnHRGP基因序列，得到相蛋白质氨基酸序列（图2），共包含13个可能的开放阅读框（opeeadingframe，简称ORF），其中表达最为完整的ORF对应的氨基酸序列即为AnHRGP基因序列编码的蛋白质序列。运用Protparam工具分析AnHRGP的氨基酸组成及理化性质得到，AnHRGP由202个氨基酸组成（表2），其中占比例最多的是Pro（19.8%），最少的是Lys（0.5%）;蛋白质分子式为C956H1 514N292O262S21，总原子数为3 045，相对分子质量为21 963.60;负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为6个，正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为25个，理论等电点（pI）为9.85，为碱性;在280 nm波长处，AnHRGP的消光系数为18 085 L/（mol·cm）（假设所有半胱氨酸均来自胱氨酸）或16 960 L/（mol·cm）（假设无半胱氨酸残基存在）;不稳定系数为94.75（>40），预测为AnHRGP为不稳定蛋白;脂肪系数为55.15;总平均亲水性为0.307（>0），预测显示，AnHRGP为疏水蛋白。

2.2 AnHRGP的信号肽、跨膜结构域预测及亚细胞定位

SignalP 4.1 server是一个信号肽预测的在线软件，主要用于预测给定氨基酸中是否含有信号肽。用SignalP 4.1 server信号肽预测工具对AnHRGP进行在线预测，结果（图3）显示，原始剪切位点分值（C-score）和被结合剪切位点分值（Y-score）均为0.118，信号肽分值（S-score）为0.190，所有分值都不超过0.2，表明AnHRGP不含信号肽，属于非分泌型蛋白，并且可以推测在细胞内该蛋白不进行跨膜运输。

应用TMHMM Server v.2.0在线预测工具对AnHRGP进行跨膜结构预测分析，结果（图4）显示，该蛋白质不具有跨膜螺旋（TMHs）结构，因此其没有跨膜区，非跨膜螺旋区（ExpAA）预测分值为1.516 78（<18），表明该蛋白是非跨膜蛋白;蛋白质的N端位于膜内侧的概率为0.123 23，其中第1位到第202位全部位于膜外，说明AnHRGP基因编码的蛋白质是非跨膜蛋白。应用SOSUI在线预测工具对AnHRGP的可溶性进行分析，结果表明，该蛋白质为不溶性蛋白。利用PSORT工具对AnHRGP的细胞内定位进行在线预测，结果（表3）显示，该蛋白质位于叶绿体中的可能性最大，其次是线粒体基质空间。

2.3 AnHRGP的亲疏水性预测

通过ExPASY ProtScale蛋白质分析工具对AnHRGP氨基酸序列的亲疏水性进行在线预测。预测结果（图5）显示，肽链中的第179位点分值为正值最大值（2.222），为氨基酸位点的疏水性峰值，第105位点分值为负值最低值（-3.111），表示亲水性在该氨基酸位点达到最强。AnHRGP氨基酸序列的C端和N端都是正值，表明两端都为疏水性;分值大于零的情况明显多于其为负值的情况，因此可以预测，AnHRGP为不溶性的疏水蛋白质。

2.4 AnHRGP的二级结构及模体预测分析

通过SOMPA在线预测工具对AnHRGP进行二级结构预测，结果（图6）显示，该蛋白中有21个氨基酸残基呈α-螺旋结构，占整条肽链的10.40%;24个氨基酸残基呈延伸链结构，占整条肽链的11.88%;7个氨基酸残基呈β-转角结构，占整条肽链的3.47%;150个氨基酸残基呈无规则卷曲结构，占整条肽链的74.26%。说明AnHRGP的二级结构主要由无规则卷曲结构构成，其他二级结构也占一定比例，但相对较低。

利用PredictProtein工具对蛋白质肽链中二硫键进行预测分析，结果显示，该蛋白不存在二硫键;运用PROSITE工具对AnHRGP进行蛋白质模体预测分析，结果（表4）显示，AnHRGP有2个磷酸化位点，且2位点重叠，蛋白质氨基酸位点磷酸化有利于激活植物的防御机制;第4～119位点为Proline-rich region（脯氨酸富集区），第136～174位点为Cysteine-rich region（半胱氨酸富集区），它们为HRGP的标志性特征。

2.5 AnHRGP的卷曲螺旋域与保守结构域分析

通过ExPASy COILS工具对AnHRGP的卷曲螺旋域进行在线预测分析，從图7可以看出，蛋白质每个位点的预测分值均为0，表明该蛋白质无卷曲螺旋倾向，在有权重和无权重的情况下预测结果是一样的，因此得出AnHRGP不含有卷曲螺旋域。

利用NCBI-CD search工具分析AnHRGP的氨基酸序列保守结构域，结果（图8）显示，AnHRGP基因编码的是富含羟基脯氨酸糖蛋白，分析结果未获得该蛋白的保守结构域、活性结合位点和基因家族信息;该蛋白序列中存在3个CB区域（compositionally biased region），表明在现有数据库信息条件下无法完全认识该蛋白质的超二级结构。

2.6 AnHRGP三级结构建模及模型评估

应用SWISS-MODEL软件在线对AnHRGP进行三级结构同源建模，结果显示，序列同源性比对相似度较低，无法进行同源建模;应用Phyre2软件在线对AnHRGP进行折叠识别建模（图9），该模型基于早期endosomal自身抗原1蛋白三维结构模型建立。通过Phyre2 Investigator中Ramachandran analysis对AnHRGP的三级结构模型进行评估分析，结果（图10）显示，该模型存在不准确的模型结构点， 可能由肽链骨架的φ、ψ角所致。

3 讨论

本研究运用目前预测可靠性较高的在线预测网站在基因与氨基酸的微观层次对AnHRGP基因进行分析，得到了AnHRGP基因序列的ORF，通过对该ORF编码的氨基酸序列进行推导，得到具有202个氨基酸的蛋白质序列，预测得到，该蛋白相对分子质量为21 963.60，理论等电点为9.85。AnHRGP显碱性，不含信号肽和跨膜螺旋，属于不溶性疏水蛋白。AnHRGP的二级结构主要由无规则卷曲结构构成，其他二级结构也占一定比例，但相对较低;其无卷曲螺旋域，存在2个磷酸化位点，且2位点重叠，有利于激活植物的防御机制;第4～119位点为Proline-rich region（脯氨酸富集区），第136～174位点为Cysteine-rich region（半胱氨酸富集区），它们为HRGP的标志性特征。

AnHRGP不含有卷曲螺旋域，不具有保守结构域，无类似基因家族，无各种活性位点，由于数据库中不能找到多种与AnHRGP同源性较高的氨基酸比对序列，其三级结构有较大比例未覆盖区。由于技术条件限制，无法对该蛋白质的超二级以及三级结构进行更为清晰的研究。本研究基于已有的生物信息学理论对AnHRGP进行分析，结果可为莜麦作物的研究提供参考，同时可为整个HRGP的研究提供帮助。

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