摘 要：为研究梨雄性不育表现和细胞学特征，观察分析了新高、爱宕和丰水(对照)梨花器官特征、花粉数量和育性，比较了花药和小孢子发育过程的细胞学特征。结果表明，新高、爱宕花药较小，花药内花粉粒数量很少、且活力低，表现出雄性不育的空囊花药。新高小孢子败育主要发生在单核晚期，但在小孢子母细胞减数分裂期就表现出部分异常；爱宕小孢子败育也主要发生在单核晚期，而此前发育正常。认为新高、爱宕小孢子败育可能与绒毡层提前解体有关。
关键词：梨；小孢子；雄性不育；细胞学
中图分类号：S661．2 文献标识码：A 文章编号：1009-9980(2007)04-433-05
新高(Niitaka)(天之川×今村秋)和爱宕(Atago)(二十世纪×今村秋1梨为日本梨品种，上个世纪由日本引入中国，2者具有雄性不育特性。梨是典型的配子体型自交不亲和性果树，生产中必须配置授粉品种或人工辅助授粉，才能获得应有产量和品质。因此，了解梨品种的花粉数量、育性具有重要意义。目前新高和爱宕花粉败育的时期和机制尚未见报道。我们以薪高、爱宕为试材，以可育品种丰水(Housui)为对照，探讨新高、爱宕花粉败育的过程和途径，为分析和利用不育材料提供试验依据。
1 材料和方法
样品采自南京农业大学江浦园艺站梨资源圃内，供试品种新高、爱宕和丰水梨。自2005年2月下旬花芽萌动前开始取样至4月初开花期为止。定期采集花芽，1周2次，剥除鳞片后，用FAA固定液固定，常温保存。石蜡切片，厚度6～8 μm，铁矾－苏木精染色，固绿复染，中性树胶封固，光学显微镜观察并拍照。
初花期(2005年4月－8日)采集新高梨、爱宕梨及对照丰水梨即将开放的大花蕾或初开花各100朵观察花器官特征，并用游标卡尺测量花器官长度，随机测量20朵花，取平均值；剥出花药，一部分用于花粉量测定，一部分散粉后用于花粉萌发率的测定，具体方法参照张绍铃等的方法。数据结果应用SPSS数据分析软件分析差异显著性。
2 结果与分析
2．1 新高、爱宕梨雄性不育性的表现
将新高、爱宕及对照丰水梨大花蕾进行花器比较观察(表1)，除花药外，新高、爱宕梨花器官形态正常，爱宕花朵较小，花器官也最小，新高花朵较大，花器官(包括花丝长)也最大。爱宕花药小，颜色浅，用手指轻捻无可见花粉。新高花药较大，但比丰水花药小，尤其花药横径较短，不饱满，轻捻亦无可见花粉。丰水花药最大，饱满，用手指轻捻有大量花粉。
不同品种的成熟花药的花粉粒数差异很大，新高和爱宕梨单花药的花粉量分别为462粒和183粒，分别为对照丰水梨(6689粒)的6.9％和2.7％，表明新高、爱宕梨花药花粉量很少，远低于丰水梨；每朵花的花药数也因品种不同而异：主要因为单花药花粉量不同，新高、爱宕花朵花粉量与丰水梨有极大差异，分别只有丰水梨的7.2％和2.3％，这表明新高、爱宕花朵花粉量很少(表2)。
雄性不育品种新高、爱宕梨的花粉萌发率也极低，分别只有4.4％和2.4％，而且萌发的花粉管长度很短，只有雄性可育品种丰水梨(花粉萌发率84.8％)的3.2％(表2)。表明新高、爱宕梨不仅花粉数量稀少，而且仅有的花粉发育不良，无生活力或生活力很低。
2．2 丰水花药和小孢子发育过程
梨树越冬前，雄蕊原基已经形成并开始分化。早春气温回升，花药继续分化。在2月下旬至3月上旬，即花前1个月，花药壁分化完全，从外向内依次为药室内壁、中层(2层)、绒毡层，呈同心圆排列，圆心处为小孢子母细胞(图版-1)。绒毡层细胞较大、多核，细胞质均匀紧密，染色较深(图版-1)。花前20 d，小孢子母细胞即花粉母细胞分离，减数分裂开始(图版-2)。此时绒毡层细胞具退化迹象，细胞形状开始不规则，排列也开始疏松；中层细胞贮藏物质减少，细胞变为扁平状，以后逐步解体被吸收(图版-2)。随后小孢子母细胞完成减数分裂形成大小均匀的四分体(图版-3)。花前15 d，四分体解体，单核小孢子游离出来。刚游离的小孢子较小，形状不规则，核较大、细胞质较浓；药室内壁正在发育，绒毡层内含物减少，中层已变成一薄层(图版-4)。小孢子逐渐发育，体积增大、变圆。花前10 d，小孢子继续发育，体积迅速增大，细胞核从中央移至细胞的一侧，小孢子壁已发育的非常明显(图版-5)。花前5～7 d，单核晚期的小孢子的细胞核进行有丝分裂，生成2个子核，形成大小不等的2个细胞：生殖细胞和营养细胞。双核花粉粒积累营养物质，染色较深，此时，绒毡层显著解体，核消失，内含物消失殆尽(图版-6)。4月初，梨树初花。丰水梨花粉粒发育成熟，绒毡层和中层消失，仅余部分残迹；两相邻药室相通，裂腔开裂，准备散粉(图版-7)。
2．3 新高、爱宕花药发育和小孢子败育过程
新高花药发育比丰水早2～3 d，开花也早一些。新高花药发育前期发育正常，形成正常的小孢子母细胞，药壁组织也正常(图版-8)。在减数分裂期，新高部分花药部分药室的小孢子母细胞异常，绒毡层也发生解体(图版-9)。但大部分花药大部分药室小孢子母细胞能够正常进行减数分裂，形成正常的四分体。新高四分体可以正常分离，并可以正常发育至单核晚期(图版-11)，也有部分药室小孢子刚分离，绒毡层即明显退化(图版-10)。单核晚期，绒毡层细胞细胞核消失，组织崩溃；大部分小孢子此时停止发育，内含物消失，多数小孢子还保留完整的细胞核(图版-12)。双核花粉期，小孢子继续解体，绒毡层和中层基本消失，仅留部分残迹，药室开始收缩，药室内壁仍能发生正常的带状纤维质加厚(图版-13)。花粉成熟期，新高花药药室已空(图版-14)，仅残留部分降解产物及少数残余花粉粒。药室内壁能够正常加厚，花药也能正常开裂(图版-14)。
爱宕花药发育早期比较正常，一直到单核细胞分离，都是正常的(图版-15)。单核晚期，绒毡层细胞细胞核大部分消失，组织开始解体；小孢子也停止发育、空泡化(图版-16)。随后小孢子发生解体，绒毡层解体消失，仅留部分残迹(图版-17)。与新高类似，大部分小孢子解体后，药室发生收缩。至花粉成熟期，花药表现与新高类似：药室内壁可以正常加厚，花药也能正常开裂(图版-18)。
3 讨论
新高、爱宕梨花器官形态正常，雄蕊形状正常，花药较瘦小．花药内有少量花粉，大多数花粉无生活力，极少数花粉还有较弱的生活力，败育并不完全。韩爱华等总结雄性不育品种新梨7号的形态特征为：花器小，花瓣均较小；雄蕊花丝短、且细，花药瘦小、干瘪，无花粉粒或只有极少数花粉粒，表现出雄性不育的空囊花药，但雌蕊发育正常。爱宕的花器官形态特征与新梨7号相似，而新高的花朵较大，除花
药外，花器官形态大小均正常。
新高、爱宕花药发育至花蕾即将开放时，花粉囊中的花粉大部分消失，花粉囊收缩，这与新梨7号的花粉成熟期表现相似，也类似于岗山白桃等的空花粉囊现象。新高、爱宕单核晚期绒毡层迅速解体，而可育花药的绒毡层在双核期才会发生全面衰退。绒毡层是药壁的最内一层，它包围着花粉母细胞或小孢子，在花粉形成和发育中起着重要作用：转运营养物质，保证小孢子发生发育的需要；合成胼胝质酶，分解包围四分体的胼胝质壁；提供构成花粉外壁的孢粉素；产生外壁蛋白等。此外，绒毡层还控制药室内壁的加厚。在花粉发育过程中，绒毡层细胞自然降解消亡。绒毡层细胞的适时解体，可以及时提供花粉发育所需的营养物质，并为花粉粒体积激增提供空间。绒毡层的降解可能是由于绒毡层细胞的程序性死亡(programmed cell death)或细胞凋亡(apopto－sis)引起的。绒毡层发育和降解的异常，往往会影响小孢子的正常发育。大多数研究认为，花粉败育是因为绒毡层异常，即绒毡层细胞在花粉形成和发育过程中过度肥大液泡化、提前或延迟退化。罗来水等研究发现，花药空囊是桃雄性不育的主要表现形式之一，并分析绒毡层异常是导致花药空囊产生的主要原因。何天明等研究了新梨7号小孢子败育过程，认为新梨7号小孢子败育主要发生在单核小孢子期，单核花粉的解体与囊壁绒毡层的液泡化与增生关系密切：绒毡层的异常分化直接导致单核花粉产生营养障碍而停止正常发育，同时导致纤维层分化不良，囊壁不开裂。新高、爱宕小孢子败育过程与新梨7号相似，小孢子败育的原因可能与绒毡层提前解体有关：新高、爱宕绒毡层细胞程序化死亡发生紊乱，绒毡层提前降解，导致大部分小孢子得不到足够的营养物质，以致小孢子败育。少数幸存的花粉粒发育不良，生活力低。与新梨7号不同，新高、爱宕的药室内壁能够正常发育，药室也能够正常开裂。这可能因为新高、爱宕绒毡层解体稍迟，药室内壁的发育未受影响。
Laser等曾指出植物雄性不育花药的败育可以发生在小孢子发育的任何一个时期，单子叶植物多数在单核至双核期，双子叶植物多发生在四分体至小孢子形成期。由于不同的不育系控制雄性不育的基因不同，雄性不育系小孢子的败育时期会凶为基因的表达时期和基因的作用方式的不同而不同。因此，不同植物种类的雄性不育系甚至同一种类的不同雄性不育系败育的时期和方式都是不同的。凡军民研究的3个大豆CMS不育系，因质、核不同败育时期也不相同，其中NJCMS2A小孢子大量败育发生在单核晚期，在大量败育之前，自小孢子母细胞期至单核期均有部分败育发生。本试验观察到新高小孢子败育过程与之类似，爱宕小孢子败育的主要时期与新高一致，败育过程则简单一些。研究表明，植物雄性不育是由基因控制的，本试验的形态解剖结果是基因表达的结果，因此与爱宕相比，新高控制雄性不育的基因可能更为复杂些，与此相关的基因尚有待于进一步研究。
4 结论
新高、爱宕花器官形态正常，其中雄蕊除花药外形状正常，花药较小不饱满：新高、爱宕花药都有少量花粉，少数花粉还有较弱的生活力。新高和爱宕小孢子败育的主要时期都是单核晚期，只有少数小孢子可以完成发育；新高、爱宕单核晚期绒毡层迅速解体，同时小孢子停止发育、开始败育，而可育花药的绒毡层在双核期才会发生全面衰退；研究认为新高、爱宕小孢子败育与绒毡层提前解体密切相关。
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