不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物多样性的动态分析

摘要：【目的】动态分析不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物的多样性，为科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良提供理论依据。【方法】分别于罗非鱼养殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）采集罗非鱼肠道样品，以试剂盒提取肠道总细菌DNA，经PCR扩增后对16S rDNA的V3～V4区进行高通量测序，并对肠道微生物进行物种组成差异分析。【结果】各样品测序中Tag数量平均为60694条，测序长度平均为440 bp，OTU Shannon稀释曲线趋于平缓并达到平台期；平均OTU数量排序为C2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667），chao1、ACE、Shannon和npShannon指数也表现出相同规律，但Simpson指数的排序为C2期（0.0405716）C3期>C1期。在各养殖阶段微生物种群数量占2.00%以上有11个门和14个属，优势菌群有所差异，随养殖周期的推移，乳球菌属所占比例逐渐下降，芽孢杆菌属、假单胞菌属和分支杆菌属呈先增后减的变化趋势，梭菌属和邻单胞菌属在养殖前期所占比例最高。此外，不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群存在一定差异，但也存在相似之处，如养殖前期以栖水菌属最具代表性，中期主要以芽孢杆菌科丰度最高。【结论】不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物组成差异明显，且不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群也存在一定差异，可能与鱼种来源、养殖环境及饲料有关。因此，生产中应结合实际情况，科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

关键词： 罗非鱼；肠道微生物；群落结构；多样性；高通量测序

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1415-08

0 引言

【研究意义】鱼类肠道微生物存在于肠道壁、肠道黏膜及其内容物中（Cheesman and Guillemin，2007；Dethlefsen et al.，2007），是鱼类肠道的重要组成部分（宋增福和吴天星，2007；吕欣荣和肖克宇，2008），在维持机体代谢、发育及进化等方面发挥重要作用（赵明晓和贺永亮，2008；Bosch and McFall-Ngai，2011；Goodman and Gordon，2010）。鱼类肠道微生物处于特殊的肠道环境和水体环境中，极易受食物和环境等因素变化的影响，鱼体自身的生长也会影响其肠道微生物的群落结构（Spanggaard et al.，2000；Savas et al.，2005）。因此，研究分析鱼类肠道微生物的多样性，对筛选益生菌或调控其养殖环境等具有重要意义。【前人研究进展】目前，研究鱼类肠道微生物群落的传统方法是将微生物纯化后再进行培养（覃映雪等，2007；胡秀彩等，2010），该方法可对肠道微生物的形态、性质及其群落结构等进行常规分析，但在菌落形态和颜色变化等方面易存在主观性判断（Maidie et al.，2003）。此外，有学者运用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术绘制出草鱼肠道菌群的指纹图谱（郁二蒙等，2012），虽然该技术可较全面系统分析肠道菌群的生物多样性，但在时效上仍不及高通量测序技术（秦楠等，2011）。随着分子生物学的快速发展，基于PCR的分子生物学方法越来越多被应用于肠道微生物研究（周孟姣和刘臻，2003；赵翔和安志东，2003；凌云等，2010），极大提高了研究效率及分析的准确性，为肠道微生物研究奠定了良好基础（李凤和刘世贵，2003；任南琪等，2007）。其中，高通量测序技术是目前基因组学研究中应用最广泛的测序技术，具有通量更高、运行时间更短、测序片段更长、成本更低等优点（孙嘉蔓等，2014；叶雷等，2016），能有效避免Sanger法的繁琐克隆过程。王绍祥等（2014）通过高通量测序技术研究了鱼类养殖环境的微生物群落特征；许燕等（2018）采用Illumina HiSeq PE250高通量测序技术研究了斑石鲷肠道的细菌多样性和群落结構。【本研究切入点】目前，采用高通量测序技术分析养殖罗非鱼肠道微生物群落结构多样性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】基于细菌16S rDNA高通量测序技术对海南省不同养殖地区整个养殖周期的罗非鱼肠道微生物多样性进行全面系统研究，为科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

分别于罗非鱼养殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）对海南三江（SJ）、文昌（WC）和屯昌（TC）的罗非鱼养殖场进行定点样品采集，每个地点采集三口池塘作为生物学重复，样品编号及其具体信息见表1。

1. 2 DNA提取及16S rDNA高通量测序

采用Sigma公司生产的Stool DNA Kit试剂盒提取罗非鱼肠道内容物总细菌DNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳和PCR进行检测。提取的DNA样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行16S rDNA高通量测序，测序区域为V3～V4区，测序平台为Illumina Miseq 2×250。

1. 3 测序结果分析

样品PCR扩增产物测序后拼接成Tag，并根据Tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析和多样品的比较分析等。利用Mothur对测序序列进行去冗余处理，使用基于Naive Bayesian的分类器RDP Classifier工具对Tag进行物种注释。计算97%相似度下的OTU数量，并根据众数原则对OTU进行物种注释。采用PICRUSt进行OTU pathway注释，以Mothur进行样品α多样性分析；采用R软件进行热图分析、PCA分析、β多样性分析和样品聚类分析；并以LEfSe分析组间菌群差异。

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