摘要：为给葡萄抗霜霉病育种研究提供理论参考，通过田间调查结合室内接种的方法测定不同品种葡萄对霜霉病的抗性；测定接种葡萄霜霉病菌后，不同抗性品种叶片的SOD、POD、CAT活性及SA、H2O2、JA含量的变化；观察喷施SA、H2O2、JA对葡萄霜霉病抗性的影响，明确萄萄抵御霜霉病菌侵染的生理生化防卫反应。结果表明，与感病品种相比，抗性品种的POD、CAT活性在接种病菌后迅速增强；不同品种的SA、H2O2含量在接种病原菌后与对照相比都有明显升高，抗病品种升高出现早、生成量更高；不同品种叶片JA含量较对照虽有增加，但品种间无差异显著性；水杨酸、茉莉酸、过氧化氢有助于增强葡萄对霜霉病的抗性，水杨酸增强抗性较为明显，抗性增强44.87%。
关键词：葡萄；霜霉病菌；不同品种；生理生化反应
中图分类号：S436.631.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0122-05
Abstract In order to provide theoretical references for grape resistance breeding against Plasmopara viticola， field investigation and indoor inoculation were used to detect the grape resistance to Plasmopara viticola. The changes of SOD， POD and CAT activities and SA， H2O2 and JA contents in leaves of different resistant varieties were determined after inoculation with Plasmopara viticola. The effects on grape resistance to Plasmopara viticola were observed after spraying SA， H2O2 and JA to clarify the physiological and biochemical defense responses of grape against the infection of Plasmopara viticola.The results showed that， compared with the susceptible varieties， the activities of POD and CAT were rapidly increased after inoculation. The contents of SA and H2O2 in different varieties increased obviously after inoculation compared with the control， and the resistant varieties showed earlier and higher formation amounts. JA content increased in different varieties， but there were no significant differences between cultivars. SA， JA and H2O2 were helpful to enhance the resistance of grape to Plasmopara viticola. SA enhanced the resistance obviously and the resistance was enhanced by 44.87%.
Keywords Grage；Plasmopara viticola； Different varieties； Physiological and biochemical response
葡萄霜霉病（grape downy mildew）主要侵染葡萄葉片、嫩梢和幼果，造成大量叶片干枯脱落[1]。由于葡萄霜霉病在整个生长季节，只要条件适宜，病原菌孢子会反复侵染，防治比较困难[2]，因此，及时开展葡萄霜霉病抗病机理的研究，对制定有效的可持续治理技术具有重要意义。
对葡萄霜霉病抗性机理的研究，主要涉及病程相关蛋白酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物歧化酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、Glu等]、酚类物质活性、激素水平的变化[3-6]。关于酶活性变化与葡萄抗霜霉病关系研究众多，但许多观点不一致甚至相反[5-7]。水杨酸（SA）、过氧化氢（H2O2）、茉莉酸（JA）是参与植物防卫反应的重要信号分子[8，9]，参与调控植物抵御病原菌的侵染，从而增强抗性[10-12]。
山东沿海是国内主要葡萄产区，其生产规模还在不断扩大，前人主要对当地葡萄霜霉病的病原、症状进行研究[13]，但对不同葡萄品种抵御霜霉病菌侵染的早期防卫反应鲜有系统报道。本研究测定了不同葡萄品种酶活性和SA、JA和H2O2含量与霜霉病发病程度的关系，旨在为葡萄霜霉病抗性育种研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 葡萄品种
无核红宝石、蛇龙珠、玫瑰香，种植于烟台市农业科学研究院同一试验园中。
1.2 田间调查
于2016年8月15日即葡萄霜霉病的发病高峰期，对发病情况进行调查，每个品种调查4个小区，每小区选取10个新梢，病情调查采用6级记载法[14]。根据以下公式计算病情指数，通过计算病情指数分析不同葡萄品种对霜霉病的抗性。
病情指数=Σ（各级病叶数×相对级数值）调查总叶数×9×100
1.3 室内离体叶片接种及抗性测定
取田间发病的新鲜葡萄病叶，培养新鲜的孢子囊[14]，配置孢子囊悬浮液浓度至2×105 个/mL 用于接种及以下试验测定。
分别取无核红宝石、玫瑰香、蛇龙珠新枝条健康无病的4—5节位叶片，采取叶盘法进行室内接种[14]。每叶盘滴加孢子囊悬浮液20 μL。
调查发病率，计算病情指数。
1.4 接种后酶活性测定
在田间选择长势一致的蛇龙珠、无核红宝石，8株设一个小区，用手持喷壶喷雾葡萄植株4—6节位无病叶片，至叶片均匀布满雾滴，喷雾溶液为2×105个/mL霜霉病菌孢子囊悬浮液，以清水为对照。重复4次。接种后每隔2 d取样一次，测定叶片SOD、POD、CAT活性的变化，共取样6次。
SOD活性、POD活性、CAT活性测定参照赵世杰等[18]的方法。
1.5 接种后葡萄叶片内源SA、H2O2、JA含量測定
使用配制的2×105个/mL霜霉病菌孢子囊悬浮液喷施蛇龙珠、无核红宝石新梢，至叶片均匀布满雾滴，用白色塑料袋保湿，不同时段取样。重复4次。SA提取及测定参照刘玉良等[15]的方法，取不同品种葡萄新鲜叶片各0.4 g，分别提取游离态、结合态SA样品，296 nm紫外光处测其吸光度。H2O2含量的测定参照郝再彬等[16]的方法。JA含量的测定参照苏雷等[17]的方法。
1.6 喷施SA、H2O2、JA后葡萄霜霉病抗性测定
通过叶盘法，取无核红宝石新枝条健康无病的4—5节位叶片，用打孔器打取直径1 cm的叶盘，叶背面朝上放置于铺有无菌湿润滤纸的平皿中，每皿放置10个。500 μmol·L-1水杨酸、250 μmol·L-1茉莉酸及400 μmol·L-1过氧化氢，分别添加0.01%表面活性剂 Tween 20后用小喷壶喷施，至叶片均匀布满雾滴，并用 Tween 20和水混合液处理作为对照。24 h后接种2×105个/mL霜霉病菌孢子囊悬浮液，7 d后调查结果。每处理重复4个。
2 结果与分析
2.1 不同品种葡萄对霜霉病的抗性
田间调查结果显示，无核红宝石、玫瑰香、蛇龙珠的霜霉病发病指数分别为52.32、39.26及19.81；室内接种试验结果表明，三个品种葡萄霜霉病的病情指数则为67.41、49.28和43.21。综合田间及室内结果得出，无核红宝石对葡萄霜霉病较为感病，而蛇龙珠相对抗病，于是选取无核红宝石及蛇龙珠开展后续试验。
2.2 接种葡萄霜霉菌后叶片POD活性动态变化
由图1可以看出，接种葡萄霜霉病菌影响葡萄POD活性，不同品种的POD活性在接种病原菌后与对照相比都有明显升高，且不同抗性品种间差异显著。蛇龙珠葡萄叶片内POD活性在处理后第2 d就显著升高，到第4 d其活性达到最高，为8.6 U·min-1·g-1 FW，虽然从第6 d开始POD活性开始下降，但持续到第10 d，其活性依然高于对照，第12 d时与对照含量相当。感病品种无核红宝石的POD活性变化曲线态势与蛇龙珠趋于一致，但其活性在4～6 d期间显著低于蛇龙珠，且从第10 d以后与对照相比没有显著差异。
2.3 接种葡萄霜霉菌后叶片CAT活性动态变化
不同葡萄品种接种霜霉病菌后叶片CAT活性的动态变化见图2，接种后第2 d，蛇龙珠的CAT活性显著增加，2～6 d持续升高，在第6 d时其活性达到最高，为46.9 U·min-1 ·g-1 FW，是对照的3.14倍，8～10 d虽然活性下降，但依然显著高于对照，12 d与对照没有显著差异。与抗性品种相比，无核红宝石的CAT活性略有升高，只有第4 d及第6 d时，其活性显著高于对照，其他时间与对照没有显著差异。
2.4 接种葡萄霜霉菌后叶片SOD活性动态变化
与对照相比，接种霜霉菌后第2 d两品种的SOD活性就开始显著增强，皆在第4 d达到最高，后开始降低，但抗感品种没有显著差异，10～12 d抗病品种SOD活性显著高于对照及感病品种（图3）。
2.5 不同品种葡萄接种霜霉病菌后SA含量变化
由图4可知，两品种SA含量在未接种时没有显著差异，接种后都明显升高。蛇龙珠在处理3 h后，SA水平迅速持续增加，12 h时其含量达到最高值800.32 ng·g-1 FW；感病品种无核红宝石的SA含量于接种病原菌6 h达最大，但其不同时间含量都显著低于蛇龙珠。显然，接种霜霉病菌影响葡萄内源SA的生成，且不同品种间差异显著，抗病品种较感病品种SA升高出现早、生成量更高。
2.6 不同品种葡萄接种霜霉病菌后JA含量变化
由图5可见，未接种葡萄霜霉病菌时JA含量两品种间没有显著差异，接种后均有所增加，在接种12 h时达到最大，而后降低，且品种间没有显著差异。
2.7 不同品种葡萄接种霜霉病菌后H2O2含量变化
由图6可见，接种葡萄霜霉病菌前，蛇龙珠叶片内源H2O2含量为20.2 μmol·L-1 ，红宝石为19.3 μmol·L-1 ，二者间无显著差异。接种后，蛇龙珠在接种1 h时叶片中H2O2水平出现猝发现象，H2O2含量达最大，为27.80 μmol·L-1 ，在7 h时恢复到最初水平；无核红宝石叶片H2O2含量在接种1 h时有所降低，而后增加，在接种3 h时达最大，为22.2 μmol·L-1 ，而后维持在最初水平。表明H2O2参与霜霉病菌侵染葡萄叶片过程。
2.8 喷施SA、H2O2、JA后葡萄的霜霉病抗性
由表2可知，对照发病率为100.00%，SA、H2O2、JA有助于增强葡萄对霜霉病的抗性，抗性增强分别为44.87%、28.21%和15.38%，说明SA增强抗性较为明显，其次为H2O2，最弱为JA。
3 讨论与结论
病原侵染植物后会诱使植物体内次生代谢产物、植物抗菌蛋白等多种生理生化指标发生改变，从而诱导植物获得抗病性。植物体内过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）是细胞抵御活性氧伤害的酶系统的主要成员[19-21]，SOD主要清除超氧阴离子（O·2）成H2O2；POD和CAT主要还原H2O2为H2O。史娟等[7]研究表明，葡萄品种间的抗性与POD、PPO、PAL、几丁质酶活性存在一定相关性；但是吕秀兰等[5]研究表明，PPO、PAL、CAT的活性与霜霉病病情指数呈极显著负相关，SOD活性与霜霉病病情指数相关不显著，与前面的研究结果相矛盾。本试验结果表明葡萄品种间的抗病性与POD、CAT活性存在一定相关性，但SOD活性在品种间没有显著差异，与史娟及林玲[7，19]等的研究结果一致。因此，在葡萄对霜霉病的抗性反应中，POD和CAT对活性氧的清除可能作为一种功能事件参与到其中，POD和CAT活性可作为葡萄品种霜霉病抗性鉴定的辅助标准。SOD的酶活不能作为鉴定标准。
SA、H2O2、JA是参与植物防卫反应的重要信号分子[8，9]。关于SA、H2O2、JA参与葡萄对病原菌的防御反应已有报道[11，22]。SA介导的植物系统获得抗性（SAR）信号传导通路，病原物侵染后，植物SA含量上升，诱导NPR1对抗病防卫基因的活性[10]；低浓度H2O2作为信号物质通过影响葡萄叶片病程相关蛋白酶活性参与调控葡萄抵御霜霉病菌侵染，从而增强葡萄对霜霉病的抗性[11，22]；有研究表明茉莉酸类化合物具有广泛的生理效应，不仅能够调节植物的生长发育过程，而且也是非生物胁迫如紫外线、干旱与机械损伤等和生物胁迫如病虫害等生理过程中的重要调控因子[12]。本研究在田间接种葡萄霜霉病菌条件的诱导下，检测不同抗性品种叶片的SA、H2O2、JA含量的变化。结果表明，不同抗性品种的SA、H2O2含量在接种病原菌后与对照相比都有明显升高，且不同品种间差异显著，这与林志强等[11]的研究结果一致；JA在品种间没有显著差异，与林志强等[11]报道有所不同。笔者进一步测定了葡萄外源喷施SA、H2O2、JA后对葡萄霜霉病菌抗性的影响，SA增强抗性较为明显，其次为H2O2，最弱为JA。因此，SA、H2O2參与了萄萄抵御霜霉病菌侵染的早期防卫反应。
参 考 文 献：
[1] 李宝燕，王培松，王英姿. 葡萄霜霉病的生物药剂防治[J]. 农药，2014，53（11）： 853-855.
[2] 金恭玺，岳永亮，宋玉萍，等. 葡萄霜霉病初次侵染来源和初侵染的特点及防治[J]. 新疆农业科学，2015，52（6）： 1105-1111.
[3] 徐红霞， 朱建兰， 常永义. 葡萄品种对霜霉病抗性研究[J]. 中外葡萄与葡萄酒， 2004（2）： 30-31.
[4] 房玉林，宋士任，张艳芳，等. 不同品种葡萄抗霜霉病特性与叶片POD、PPO活性关系的研究[J]. 西北植物学报， 2007， 27 （2）： 392-395.
[5] 吕秀兰，张光伦，龚荣高，等. 22个葡萄品种过氧化物同工酶研究[J]. 四川农业大学学报， 2005， 23（2）： 182-185.
[6] 乔宝营，黄海帆，刘崇怀，等. 几种理化因素与葡萄霜霉病抗性的关系[J]. 果树学报， 2014， 31（5）： 901-905.
[7] 史娟，冯美，邱丰，等.葡萄感染霜霉病叶片中一些酶活性的变化[J].宁夏农学院学报，2002，23（1）： 17-19.
[8] Dong X.SA， JA， ethylene， and disease resistance in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 1998， 1（4）： 316-323.
[9] Wu G， Shortt b J， Lawrence E B， et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants[J].Plant Cell， 1995， 7（9）： 1357-1368.
[10]Ryals J A， Neuenschwander U H， Willits M G， et al. Systemic acquired resistance[J]. Plant Cell， 1996， 8： 1809-1819.
[11]林志强，郭秀萍，车永梅，等. NO和H2O2提高葡萄抗霜霉病的生理作用机制[J]. 植物病理学报， 2011， 41（6）：576-586.
[12]朱家红，彭世清. 茉莉酸及其信号传导研究进展[J]. 西北植物学报，2006， 26（10）：2166-2172.
[13]王英姿， 任强， 栾炳辉，等. 葡萄霜霉病菌田间消长动态及药剂防治试验[J]. 中国果树，2007（6）： 34-35.
[14]李宝燕， 王英姿， 刘学卿，等. 3种杀菌剂对葡萄霜霉病菌的毒力测定和田间药效试验[J]. 江苏农业科学， 2014， 42（1）： 98-99.
[15]刘玉良，米富贵，特木尔布和，等. 苜蓿叶片水杨酸含量与其蓟马抗性的关系[J].西北植物学报， 2011， 31（3）：588-594.
[16]郝再彬，苍晶，徐仲. 植物生理实验技[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2002： 198-199.
[17]苏雷，李娅，王程辉. 高效液相色谱-质谱联用法测定烟草中茉莉酸[J].分析科学学报， 2013，29（2）：253-256.
[18]赵世杰，史国安，董新纯. 植物生理学实验指导[M].北京：中国农业科学技术出版社，2002.
[19]林玲，卢江，黄羽，等. 不同葡萄品种感染霜霉病菌后叶片中几种酶活性的变化[J].南方农业学报，2014，45（2）：222-225.
[20]曾永三，王振中. 苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶活性与豇豆抗锈病性的关系[J]. 仲恺农业技术学院学报，2003，16（1）：1-5.
[21]周晓惠，Wolukau J N，李英，等. 甜瓜蔓枯病抗性与 SOD、CAT 和 POD 活性关系的变化[J]. 中国瓜菜，2007（2）：4-6.
[22]李宝燕，王培松，倪寿山，等. 不同葡萄品种对霜霉病的抗性鉴定及相关生理生化研究[J]. 果树学报，2016，33（2）：217-223.
推荐访问： 霜霉病 侵染 防卫 抵御 生化
