摘 要 着重对核酸探针的标记物、种类、检测原理等作出总结，并对它的应用前景作出展望。
关键词 RNA探针 单链DNA探针 双链DNA探针 核酸探针
中图分类号 Q-49
文献标识码 Ｅ
核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物(如酶与荧光素等)标记的DNA片段、单链DNA和RNA等。
核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。
1 核酸探针的标记物
1．1 放射性标记
放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32p、3H、35S。其中，以32p应用最普遍。
放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级；缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实现商品化；目前，许多实验室都致力于研究非放射性标记的探针。
1．2 非放射性标记
目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。
生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。
地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，运用原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记时相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。
2核酸探针检测的原理
核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交，其工作原理是碱基配对，即2条碱基互补的DNA链(或2条碱摹互补的DNA链和RNA链)在适当条件下可以按碱基配对原则，形成杂交DNA分子。
已知每个生物体的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定的，例如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有并表达了某个或某些有害的基因而产生的。从理论上讲，任何一个决定生物体特定生物学特性的DNA序列都应该是独特的。如果将某一种微生物的特征基因DNA双链中的一条进行标记，例如用nP同位素标记，即可制成DNA探针。由于DNA分子杂交时严格遵守碱基互补配对的原则，通过考查待测样品与标记性DNA探针能否形成杂交分子，即可判断样品中是否含有此种微生物，并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。
3 核酸探针的种类及制备方法
根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为RNA探针、人工合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针等几类。
3．1 RNA探针
RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A(胰RNA酶)切比用S1酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。
RNA的探针制备过程是将一段含完整或部分基因的DNA片段插人重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段中某一适当部位或插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA，然后在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。
3．2 人工合成的寡核苷酸探针
人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针，长度一般长约10～30bP，甚至可达50bp。如果已知核酸序列可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针，单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效；如果不知道核酸序列，可依据其蛋白质产物的氨基酸顺序推导出核酸序列从而合成DNA探针。
人工合成的寡核苷酸片段作为核酸杂交探针应用十分广泛，对于检测靶基因上单个核苷酸的点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
3．3 单链DNA探针
用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列2种：
(1)从M13载体衍生序列合成单链DNA探针。合成单链DNA探针可将模板序列克隆到M13噬菌体载体中，以此为模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡核苷酸为引物，在[a-32p]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到的是部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
(2)以RNA为模板，用反转录酶合成单链eDNA探针。eDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成eDNA探针所用的引物有下列2种。
①用寡聚(dT)为引物合成eDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3·末端序列。
②可用随机引物合成eDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂很多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA／DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针。
3．4 双链DNA探针
双链DNA探针的合成方法主要有下列2种：切口平移法和随机引物合成法。
切口平移法是目前实验室中最常用的一种DNA探针标记方法，用此法标记的核苷酸的掺入率可达20％-30％。其原理是利用DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。方法是先由DNasel在双链DNA分子的一条链上产生切口，这样E．coli DNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端。同时该酶具有从5＇→3＇的核酸外切酶活性，能从切口的5＇端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3·端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺人到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50～500个核苷酸。
随机引物法是近年来发展起来的一种较理想的标记方法，具有操作简便、标记活性高、适用范围广等特点，有取代切口平移法标记DNA探针的趋势。其原理是随机引物(一般指含有各种排列的寡核苷酸片段的混合物，此混合物可人工合成，一般长度为6个核苷酸残基)能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补原理，按5＇→3＇方向合成一条新的DNA链，其核苷酸顺序与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板分子，同样合成一条新的完全互补的DNA链。在反应体系中加入4种dNTP，其中一种带放射性核素标记的核苷酸，在合成反应中掺入到新合成的DNA分子中，使合成的DNA带有放射性核素。反应结束后，经纯化即可得到标记好的DNA探针。该法标记化合物掺人率高达70％～80％。
双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。
4 核酸探针的应用前景
在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出其巨大的应用前景。
参考文献：
[l] 刘妙良．地高辛配基标记的核酸技术．生物化学和生物物理进展，1992，19：34．
[2] 楼士林，杨盛昌．基因工程．北京：科学出版社，2002．
[3] 林万明．核酸探针杂交实验技术．北京：中国科学技术出版社，1991．
[4] 刘祥林，聂刘旺．基因工程．北京：科学出版社，2005．
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