摘 要:选取壳聚糖-戊二醛共价法对黄孢原毛平革菌所产的木素过氧化物酶(LiP)和乙二醛氧化酶(GLOX)同时进行了共固定化研究,LiP和GLOX的酶活回收率分别达到了81.4%和45.2%。实验表明:采用先活化载体后共价结合酶的固定方法比活化载体-酶固定化同时进行效果好;在选择活化剂种类上,戊二醛优于乙二醛和不加活化剂;最佳加酶量为30ml/0.4g载体;最佳戊二醛浓度为0.2%;戊二醛最佳固定化时间均为10h。
关键词:木素过氧化物酶乙二醛氧化酶共固定化壳聚糖
中图分类号:Q814.2文献标识码:A文章编号:1674-098X(2011)08(c)-0114-02
引言
黄孢原毛平革菌是一种典型的白腐真菌。它能降解木质素。其原因是它产生的胞外木质素降解酶体系,该酶系的主要酶有木素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP),乙二醛氧化酶(glyoxal oxidase,GLOX)。LiP能催化氧化各种非酚类的底物,它是依赖于H2O2的氧化反应。GLOX是黄孢原毛平革菌在产生木素过氧化物酶的同时,产生的一种胞外氧化酶,它可以氧化胞外培养液中的乙二醛和甲基乙二醛生成H2O2供Lip使用[1]。Chung[2]在研究LiP氧化苯酚时发现:溶液中的H2O2的浓度高(400μmol/L)时,LiP的快速失活,原因是LiP的催化循环的中间体LiPⅡ与过量的H2O2反应生成无活性的LiPШ。
Fred van de velde等人[3]用过氧化物酶/葡萄糖氧化酶双酶共固定化系统进行不对称氧化反应,葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖来提供氧化剂H2O2。由于高浓度的H2O2会使过氧化物酶失活,原位生成H2O2可以控制H2O2在低位,很好地保护过氧化物酶的活性。本文用类似的思想共固定化木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶。该固定化双酶体系可以控制乙二醛氧化酶原位产生的H2O2浓度在低位,从而保护木素过氧化物酶的酶活。
以壳聚糖为载体用共价法固定化酶是研究最活跃的酶固定化方法。由于壳聚糖不存在残存的单体,故它作为酶载体较其它聚合物具有更大的优越性[4]。
1材料与方法
1.1 酶液
由黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)培养得到粗酶液[5],滤纸过滤除去菌丝,再经冻溶法除多糖,超滤浓缩[6]约10倍后,4℃储藏备用。测得GLOX酶活约为170U/L,LiP酶活约为3000U/L,蛋白质含量约为1000μg/mL。
1.2 酶活力的测定和酶活二次回收率
参照文献[7]。
1.3 壳聚糖载体的制备
用质量浓度为5%的乙酸配制浓度为25 g/L的壳聚糖溶液,充分溶解或者在4℃冰箱放置过夜,制成透明胶液;在壳聚糖溶液中逐滴滴入浓度为10mol/L的NaOH溶液,同时剧烈搅拌,使壳聚糖凝胶析出;用蒸馏水洗涤至中性,抽滤,即得壳聚糖凝胶。
1.4 共固定化方法
使用两种方法进行酶固定化:(1)在1g壳聚糖所制得的凝胶中先加入一定量的戊二醛,在4℃搅拌,活化若干小时,用pH为4.5的酒石酸缓冲液洗去多余戊二醛,抽滤;再加入一定量酶液,4℃搅拌12h,静置过夜,用pH为4.5的酒石酸缓冲液洗去未固定的酶,抽滤,得固定化酶。(2)同时加入缓冲液、酶样和一定浓度的戊二醛进行处理,用pH为4.5的酒石酸缓冲液洗去未固定的酶及其它杂质,抽滤,得固定化酶。
1.5 蛋白质含量测定
采用福林-酚法[8]。
2结果与讨论
2.1 共固定化顺序的选择
分别用先活化载体后共价固定和活化载体与共价固定同时进行两种不同方法对GLOX进行固定,即固定化方法(1)和(2),结果(表1)所示。
由表1可见,若采用方法(2),双酶的酶活回收率和固定蛋白含量均明显低于方法(1),因此,采用先活化载体后共价固定法固定双酶。
2.2 载体活化剂种类的确定
分别采用戊二醛、乙二醛活化壳聚糖载体,再用其固定双酶,同时与不加活化剂直接用壳聚糖载体吸附固定双酶相比较,结果（表2）所示。
由表2可见,以戊二醛活化载体后再固定双酶的酶活回收率较乙二醛和直接吸附均要高,但乙二醛处理后的游离蛋白含量最低。我们发现,戊二醛最高,乙二醛次之,直接吸附最差。所以,以戊二醛活化载体后再共价固定双酶的效果最佳。
2.3 加酶量对双酶共固定化的影响
在0.4g壳聚糖所制得的载体中分别加入10,20,30,40,50ml酶液,其他条件同方法(1),制备固定化酶,分析加酶量对双酶固定化的影响,结果(图1)所示。
由（图1）可见,双酶的固定化酶活都随着加酶量的增加而增加;而酶活回收率却随加酶量的增加而减少。在加酶量为30ml/0.4g附近是载体活性结合位点的饱和点。综上所述,加酶量不是越大越好,兼顾固定化酶活和酶活回收率,认为加酶量取30 ml/0.4g较为合适。
2.4 戊二醛浓度对双酶共固定化的影响
分别取0.4g壳聚糖凝胶与30ml不同浓度的戊二醛(0.0%～1.0%)溶液混合,搅拌反应后静置过夜,水洗,抽滤,制成固定化载体,再将其用于双酶的共固定。结果如图2所示。
由（图2）可见,在戊二醛质量浓度为0.2%时,双酶的酶活回收率都达到最高。因此,戊二醛质量浓度应取为0.2%较为适合。
2.5 酶固定化时间的优化
采用戊二醛浓度0.2%,载体活化时间为10h,再加入30ml酶液,酶固定化时间分别取4、6、8、10和12h,其它操作同方法(1)。结果（图3）所示。
由（图3）可知,10h后游离蛋白含量的减少量开始减少,说明可能固定10h左右固定化已趋于稳定,因此,采用固定化的时间为10h较为合适。
3结语
通过实验优化了LiP和GLOX双酶共固定在壳聚糖上的固定化条件,LiP和GLOX的酶活回收率分别达到了81.4%和45.2%。实验表明:采用先活化载体后共价固定方法为佳;选择活化剂戊二醛;加酶量取30ml/0.4g较为合适;最佳戊二醛浓度为0.2%;戊二醛最佳酶固定化时间均可选用10h。
参考文献
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[3]Fred van de Velde,Martin Bakker, Fred van Rantwijk,Roger A.Sheldon. Chloroperoxidase-Catalyzed Enantioselective Oxidations in Hydrophobic Organic Media.Biotechnol Bioeng 72:523–529,2001.
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