摘要：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）与抗病毒药物更昔洛韦（GCV）组成的药物敏感基因疗法在肿瘤基因治疗领域中引人注目，它产生的旁观者效应在一定程度上弥补了基因载体转染率不高的问题，在肿瘤自杀基因疗法中发挥着重要的作用，现对HSV-TK/GCV治疗肿瘤机制及其应用趋势作一综述。
关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；更昔洛韦；旁观者效应
中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2006)02-0052-04
Mechanism research of HSV-TK/GCV system on tumor gene therapy
LI Hui1,2＊, WU Xin-rong2
(1. School of Light Industry and Food Sciences ,South China University of Technology, Guangdonga Guangzhou 510641China; 2. Department of Pharmacy , General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangdong Guangzhou 510010 China)
Abstract: Herpes simplex virus-thymidine kinase gene/ganciclovir system was noticeable in tumor gene therapy. Its bystander effect produces a marked effect in suicide gene therapy on tumor because it can make up the low transfection efficacy of gene carrier. This article reviews the therapy mechanisms and the application tendency of HSV-TK/GCV.
Key words: herpes simplex virus-thymidine kinase gene; ganciclovir; bystander effect
胸苷激酶（TK）基因存在于疱疹病毒、细菌和哺乳动物细胞中，但不同来源的TK基因，其结构及蛋白质产物的相对分子质量、理化性质、生化功能等差异很大。哺乳动物细胞TK底物范围较窄，只有疱疹类病毒的TK可以催化一些核苷类似物磷酸化，发挥对哺乳动物的细胞毒作用。自1986年首次报道单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）可提高抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对肿瘤细胞的杀伤敏感性后，药物敏感基因疗法就成为众多研究者争先探索的焦点。在近10年，学者们将HSV-TK基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞并给予更昔洛韦，体内外试验结果表明，更昔洛韦对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显，此外HSV-TK/GCV系统独特的“旁观者效应”还可以放大治疗效果，吸引了众多肿瘤患者自愿接受试验，大量临床试验资料显示，HSV-TK/GCV将是重要的抗肿瘤治疗方法之一。
1HSV-TK/GCV系统的直接杀伤作用
细胞转染HSV-TK基因后可将无毒性前体药物GCV单磷酸化，继而在细胞的一磷酸鸟苷激酶或细胞内其他激酶的作用下进一步磷酸化为二磷酸化和三磷酸化产物，以此作为dGTP的竞争性抑制物，掺入到合成的DNA中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳等，或通过抑制细胞DNA聚合酶的活性，进一步阻止DNA的合成，导致细胞分裂阻抑或死亡。由于GCV不是哺乳动物细胞胸苷激酶的良好底物，因此对人体是低毒或无毒的。
2旁观者效应及其可能的发生机制
1986年Moolten等[1]首次用HSV-TK基因转导联合GCV治疗肿瘤时就已发现，将HSV-TK+小鼠肉瘤细胞株与HSV-TK－同种细胞以9:1的比例接种培养，给予GCV后，不仅阳性细胞被杀死，而且阴性细胞也极少存活。随后，Culver等[2]将携带HSV-TK基因的逆转录病毒注射入大鼠颅内胶质细胞瘤并接受GCV治疗时也发现了类似现象，且首次提出了“旁观者效应”（bystander effect，BE）这一机制。关于HSV-TK/GCV发生旁观者效应的机制，目前较为认同的主要有缝隙连接、细胞凋亡、机体免疫、肿瘤坏死和介质扩散等学说。
2.1缝隙连接学说
缝隙连接理论由Bi等[3]首先提出并为大多数研究者认同。该理论认为，由于GCV的毒性代谢产物不能通过细胞膜，但可以通过直径约2.0 nm的缝隙连接，因此HSV-TK/GCV系统显然是通过“缝隙连接介导的细胞间通讯”（gap junction mediated intercellular communication，GJIC）功能来实现旁观者效应的。曹剑峰等[4]用特制的滤网将转染和未转染TK基因的细胞隔开共培养，马文斌等[5]将C6/TK+ 细胞在GCV的条件下培养基滤过细胞成分后加入到野生C6细胞中，都未检测到旁观者效应，这充分验证了旁观者效应依赖于细胞间的直接接触而非可溶性因子介导。值得关注的是，Wygoda等[6]发现有GJIC能力的细胞中，不仅能出现旁观者效应，而且旁观细胞对转染有TK基因的细胞也有保护作用，称之为施善效应（good samaritan effect），Wygoda推测通过GJIC排除毒性代谢产物是此现象发生的重要原因。旁观者细胞对转染HSV-TK基因细胞保护作用的发现是GJIC介导毒性代谢产物传递理论的有力支持。
2.2细胞凋亡学说
细胞凋亡学说认为，旁观者效应是由一种“凋谢小体”转移引起的，凋谢小体由TK+细胞传递到TK－细胞，导致后者死亡。这种观点由Freeman等[7]首先提出，他们经流式细胞仪及电镜分析发现HSV-TK+死亡细胞中表现出细胞皱缩，染色质浓聚和凋亡小体形成等程序性死亡特征，且标记的小体出现于旁观细胞，由此推测毒性代谢产物或TK基因表达的产物可通过凋亡小体被旁观细胞吞噬，从而引起肿瘤细胞的继发凋亡。杨学军等[8]经电镜发现许多直径为0.30μm电子密度的囊泡包绕在细胞周围，细胞由于吞噬了毒性囊泡具有了凋亡的特点。何祥梁等 [9]应用电镜、流式细胞仪、细胞凋亡原位检测法发现转染HSV-TK基因A549细胞经GCV作用后出现了明显的凋亡变化，进一步支持了凋亡相关过程的启动势引起了邻近未转染细胞相应的变化，从而可能成为其强大的旁观者效应的一种内在机制这一观点。
2.3机体免疫学说
Ramesh等 [10]用HSV-TK/GCV基因治疗免疫缺陷性荷瘤Balb/c小鼠，发现即使转染率近100%，仍不能有效地抑制肿瘤生长；而对照的免疫正常鼠转染率在50%时，肿瘤抑制率达到100%。因而认为，宿主免疫系统的完整性是自杀基因疗法所必须的。Kianmanesh等 [11]给动物的两个不同部位分别移植HSV-TK+肿瘤细胞和野生型肿瘤细胞，再给予GCV，发现野生型肿瘤也缩退，他们把这种现象称为“距离性旁观者效应”，并认为与体内出现抗肿瘤性免疫反应有关。大量且迅速的坏死细胞刺激免疫细胞（如巨噬细胞，NK细胞，CD4+、CD8 +淋巴细胞）汇集到临死肿瘤部位，并诱导炎性细胞因子释放，炎性反应提供一个危险信号给免疫系统来提高免疫反应和克服免疫耐受状态。此外，大量的细胞坏死提供足够的抗原来激活抗肿瘤免疫反应，因此人为地增强免疫对促进肿瘤彻底清除，延长动物生存期有重要意义。
2.4肿瘤缺血坏死假说
Ram等[12]在9 L胶质瘤基因治疗中发现，由于体外旁观效应没有血管存在，而体内肿瘤分泌血管生长因子，导致肿瘤内血管的内皮细胞有丝分裂活跃，易被携带HSV-TK基因的逆转录病毒载体所转染，经GCV治疗后，肿瘤血管内皮细胞被有效地杀伤，从而抑制了肿瘤血管生长，减少肿瘤的血供，使肿瘤缺血、坏死。
2.5介质扩散假说
在有些双自杀基因情况下，互相不接触的肿瘤细胞也能发生旁观者效应。郭语彬等[13]在研究融合自杀基因（CD-TK）的旁观者效应时将转染肺癌细胞（SPC-A-1/CD-TK）和未转染的肺癌细胞（SPC-A-1）按不同密度培养后，加入前药GCV和5-氟胞嘧啶（5-FC），观察到当细胞密度稀疏时旁观者效应较为明显，原因可能是胞嘧啶脱氨酶（CD）能够催化对细胞无毒的5-FC转化为细胞毒性的5-氟尿嘧啶（5-FU），与GCV的磷酸化产物相比，5-FU的旁观者效应更为明显，且5-FU可以自由穿过细胞膜，通过细胞间介质扩散，造成细胞接种密度较低者的CD-TK和前体药物体系的旁观者效应高于接种细胞密度较高者。
3TK基因应用趋势
TK基因治疗肿瘤的研究领域相当活跃，从细胞水平到动物体内，再到临床试验，且有部分肿瘤，如脑胶质瘤、黑色素瘤等已获准可用该基因进行临床治疗。临床实验的疗效与动物实验的结果差距较大。为了取得理想的治疗效果，不断提出许多改进策略，主要包括：（1）提高缝隙连接的通透性。缝隙连接通道的主要成分是连接蛋白，它的异常与肿瘤发生、发展密切相关。除转导编码缝隙连接蛋白的Cx26、Cx37、Cx43基因外，尚有化学物质可以上调肿瘤细胞GJIC功能，如3",5"-环磷酸腺嘌呤核苷（cAMP）[14]、姜黄水解物[15]、维甲酸[16]等可协同肿瘤化疗的杀伤作用；（2）提高机体的免疫功能。TK基因与肿瘤抗原或免疫基因如IL-2[17]、G-CSF[18]等共同转染，可以产生协同效应，TK基因可以大量杀伤肿瘤细胞减少负荷；此时免疫基因引起的局部微环境免疫增强，而残存瘤组织则由细胞毒性淋巴细胞浸润来杀灭。许多中药亦能有效地改善荷瘤机体的免疫状态，可建立自杀基因疗法联合中药肿瘤基因治疗方案[19]；（3）采用双自杀基因疗法。双自杀基因转染如TK两基因和CD两基因均为自杀基因，两者联合应用可以产生协同作用已有报道[20]，再利用低剂量放疗将有更强的杀伤作用；（4）联合p53基因治疗。许多p53基因突变的肿瘤细胞可以对抗自杀基因转换前药物对癌细胞的杀伤作用，为克服此影响，将HSV-TK自杀基因与野生型p53基因共转染，对肿瘤细胞有更强的杀伤作用[21]；（5）联合抑制凋亡的基因。有学者将抑制凋亡的Bcl-2基因导入TK+细胞，延缓它们由GCV介导的死亡时间，使它通过缝隙连接转运毒性代谢产物的时间延长，增加了旁观者效应的作用时间和能力[22]；（6）改变载体特性。利用有复制能力的病毒作载体，可以使感染细胞内外源基因复制数增加，从而更好地表达外源基因[23]；（7）病毒载体导入方法的改进。利用携带肿瘤特异性调控元件的病毒作为自杀基因的载体，使自杀基因的表达只局限于肿瘤细胞，减少正常细胞的损伤，从而达到靶向基因治疗的目的。Suzuki等[24]将前列腺特异性抗原（PSA）启动子、增强子先用ARF（Partial androgen receptor）处理激活（目的提高PSA的活性），然后构建ARF-PP-HSV-TK/GCV系统，发现它能有效地抑制前列腺癌细胞的生长；（8）应用HSV-TK突变体。Black等[25]用随机序列诱发HSV-TK产生突变，目的是分离出对GCV敏感性增强的HSV-TK突变体。Chu等[26]利用真核起始因子4E（eIF4E）在癌细胞中过度表达的现象，在腺病毒携带的HSV-TK基因的上游接合上5"非翻译区（5"UTR），形成特异性针对eIF4E 的Ad-HSV-UTK，显著提高了乳腺癌小鼠的无病生存时间和总存活数。其它增强旁观者效应的方法还有联合放疗、化疗等。
4结语
近年来，肿瘤基因治疗得到了长足的发展，其中自杀基因/前体药物体系中HSV-TK/GCV系统应用最广泛，研究也较深入，尤其是它所具有的旁观者效应更是多种机制造成的综合效应。在转染自杀基因细胞周围发生的旁观者效应可能是通过缝隙连接和细胞凋亡引起，而远距离旁观者效应则很可能依赖于宿主体内出现的抗肿瘤性免疫反应和肿瘤缺血管的坏死，而利用TK和其他自杀基因的联合疗法中，旁观者效应则更可能依赖于另一基因的介质扩散作用。因此，旁观者效应抑制肿瘤是多种因素共同参与的，在提高转染率有限的情况下，阐明其机理，增强其作用，甚至制备个体化基因修饰的肿瘤细胞，将抗癌局部的“旁观者效应”转化为全身性或区域性治疗，这无疑对加速癌症治疗的发展具有重要意义。
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