摘 要：SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化，在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础，通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因，命名为TaSnRK2.2，并提交到GenBank（登录号：KJ850253）。TaSnRK2.2基因全长4 118 bp，由9个外显子和8个内含子组成，包含一个1 026 bp的开放阅读框，编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。TaSnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 kD，理论等电点为5.45，含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了TaSnRK2.2基因过表达载体，转化拟南芥，获得转基因植株，通过RT-PCR方法检测到TaSnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。
关键词：小麦；非生物胁迫；TaSnRK2.2；克隆；转基因
中图分类号：S512.1+Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0001-07 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约有35%的人口以小麦为主食，在中国粮食消费总量中，小麦占43%以上。我国地理环境复杂，自然灾害多发，干旱、盐碱以及极端温度等环境因素严重影响小麦产量，威胁小麦粮食生产安全。植物在长期的进化过程中形成了一系列应对复杂多变环境、抵御逆境胁迫的调控机制，众多的调控和防御类基因构成了植物应答和抵御逆境胁迫的分子生物学基础[1～3]。
研究表明，蔗糖非发酵相关蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase， SnRK）参与蛋白质的磷酸化，在植物激素信号传导、抵御非生物胁迫和调节植物生长发育等方面发挥重要的作用[4～6]。根据序列相似性和结构域特点，高等植物SnRK基因家族被分为3个亚族：SnRK1、SnRK2、SnRK3[7]。SnRK1基因已经从不同的植物中分离和鉴定，其参与植物氮元素、蔗糖以及脂质的代谢、器官发育与衰老等过程[8～11]。SnRK3基因又称类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶（calcineurin B-like protein interacting protein kinase， CIPK）基因[12，13]，能够介导Ca2+信号的传递和提高植物的抗逆性[14～17]。SnRK2基因数目较少，编码植物特有的蛋白激酶，主要参与植物应对逆境胁迫、养分利用和生长发育等过程，到目前为止已经鉴定了10个家族成员，统一命名为SnRK2.1～SnRK2.10[18]。
在小麦中，多个SnRK2基因家族成员已经被克隆并进行了功能验证。PKABA1是第一个被克隆的SnRK2家族成员，可被水分胁迫和脱落酸（Abscisic acid， ABA）诱导表达[19，20]。TaSnRK2.3可被聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、ABA、NaCl以及冷胁迫诱导，转TaSnRK2.3基因的拟南芥植株失水率下降，光合作用增强，细胞内脯氨酸含量增加，提高了对干旱、盐渍以及冷害的耐受性[21]。转TaSnRK2.4基因拟南芥植株较对照增加了对干旱、盐分以及冷胁迫的抵抗能力，同时种子萌发延缓、初生根增长以及生物量增加，表明TaSnRK2.4在植物抗逆性和生长发育方面发挥作用[22]。转TaSnRK2.7基因的拟南芥同样增加了对多种逆境胁迫的抗性，但其活性不被ABA诱导，说明TaSnRK2.7参与非ABA信号转导通路[23]。转TaSnRK2.8基因的拟南芥除增强了对逆境抗性外，其可溶性糖含量降低，说明TaSnRK2.8在碳水化合物的代谢中发挥作用[24]。小麦W55a也属于SnRK2家族成员，该基因受干旱等非生物胁迫的诱导[25]。以上研究表明，小麦SnRK2基因在抵御非生物胁迫方面发挥重要作用，并且参与植物的生长发育和碳水化合物的代谢过程。
随着植物基因工程技术的发展，利用分子生物学方法克隆小麦抗逆相关基因，研究其生物学功能，探索植物抗旱分子机理是近来研究的热点。水稻SAPK2基因是植物SnRK基因家族成员之一，本研究利用水稻SAPK2基因通过同源克隆的方法得到一个新的小麦SnRK2基因家族成员——TaSnRK2.2，并构建该基因的植物过表达载体，转化拟南芥，为进一步研究该基因的功能及在逆境条件下的表达特征奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 小麦品种鲁麦21用于TaSnRK2.2基因cDNA及gDNA的克隆和序列分析。Columbia型拟南芥用于遗传转化。
1.1.2 菌株和载体 大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1和克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌菌株GV3101和表达载体PBI121由本实验室保存。
1.1.3 酶、试剂盒及其他耗材 LA Taq酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶以及dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司。反转录试剂盒The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其它化学药品为国产分析纯。
1.1.4 引物和测序 本试验所用PCR引物合成及DNA测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA、gDNA提取和第一链cDNA合成 小麦总RNA提取步骤按照TRIzol试剂说明书进行。小麦gDNA的提取参照改良的CTAB法[26]进行。第一链cDNA的合成参照The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。
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