摘要 近年来油菜的遗传转化体系发展迅速，从遗传转化方法、所采用的外源基因以及转基因油菜的安全性等方面综述了基因工程在油菜遗传改良中的研究进展。
关镶词 油菜；基因工程；遗传改良
中图分类号 Q789 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）08-0104-03
油菜是中国继稻、麦、玉米、大豆之后的第5大作物，在农业生产上占有重要地位。目前生产上主要栽培的是甘蓝型油菜，自从1985年获得第1例转基因甘蓝型油菜以来[1]，人们越来越重视通过基因工程的方法改良油菜品种。油菜基因工程目前研究的重点主要放在再生体系的建立、转化的目的基因和遗传转化的方法上。
1再生体系的建立
1.1子叶、下胚轴为外植体的再生体系
不同的外植体对再生体系的建立和转化有不同的影响，近年来许多学者分别以油菜子叶、下胚轴、茎段为外植体来研究其再生条件。研究结果表明，其分化率随基因型不同、激素比例不同及取材时期而变化。Dele等[2]发现苗龄为3～5d的子叶柄细胞比5d以上的再生能力强。石淑稳等[3]对华双2号的带柄子叶和无柄子叶进行了对照培养，发现不带柄的子叶仅能够膨大和于切口处形成愈伤组织。Moloney等[4]和程振东等[5]作了进一步研究，认为加入AgNO3可以提高芽的分化率。赵云等[6]以6个甘蓝型油菜的子叶为外植体，比较2，4-D、IAA、2T、BA的浓度对不同基因型分化的影响，研究表明，以2，4-D浓度1mg/L和BA浓度2mg/L的MS培养基最优，84%以上外植体长出愈伤组织，其中34%长出芽点。以子叶、下胚轴为受体，具有简便、快速等优点，但再生植株易为嵌合体。
1.2原生质体再生体系的建立
原生质体指去掉细胞壁后具有活力的裸露细胞。原生质体本身具有其独特性，如一次制备可以获得大量均匀的细胞，容易摄入外源遗传物质，以它为受体可以得到高度纯合体。能作为油菜原生质体培养的材料很多，如叶、茎、根、下胚轴等。但原生质体形成愈伤组织受多种因素影响，Kahlenbach等[7]试验发现，油菜原生质体的分裂和细胞团的发育要求附加生长素，尤其是2，4-D和细胞分裂素的配合使用。李文彬等[8]以浓度3mg/L的BA和浓度0.5mg/L的GA3配合使用成功地诱导出Bijuncea的愈伤组织芽分化。
1.3小孢子再生体系的建立
小孢子培养技术是获得大量单倍体的主要途径，已广泛用于油菜等作物的遗传育种及转基因研究。由于小孢子本身具有单细胞性，用它作为转化受体进行外源基因导入，不仅有利于基因表达，还可加速转基因材料的纯合，大大缩短育种年限。
Licther首先报道了在芸薹属甘蓝型油菜中取得了游离小孢子培养。陈军等[9]以中双1号、中双3号、89008等油菜品种，建立了甘蓝型油菜游离小孢子再生胚状体的试验体系。段英姿等[10]研究认为，小孢子发育成胚的过程中早期需较高的蔗糖浓度（13%），中期浓度降到较低水平（3%～9%）为宜，这样可以提高胚状体的诱导频率。周伟军等[11]采用秋水仙碱与高温热击处理甘蓝型冬油菜F1杂种分离小孢子，获得了较高的出胚率和成苗率。
2转化的目的基因
2.1转化品质改良基因
2.1.1油菜种子贮藏蛋白的遗传改良。通常情况下，种子中的油脂和蛋白质占有量分别为40%和20%，种子中的贮藏蛋白主要为napin和cruciferin。Kohno-Murase等[12]将编码napin蛋白的反义基因导入westar，发现转基因后代种子中crudiferin的含量比对照提高了1.4～1.5倍，但蛋白质的增加，并没有影响种子脂肪酸的含量。
2.1.2油菜脂肪酸的遗传改良。芥酸及其衍生物是制造塑料胶片及润肤剂的重要原材料，一般通过传统育种的方法可以培育出含芥酸66%的品种，利用转基因技术却可以培育出含量超过80%的材料[13]。Vesnakatavic[14]将拟南芥的FAEl基因和酵母的SLCH基因导入甘蓝型油菜使芥酸含量有所提高。Kohnomurase等[15]报道，将反义napin基因导入油菜，降低了脂肪酸含量，提高了亚麻酸含量，硫脂酶基因的导入使中链脂肪酸含量达到75%，同时硫甙含量降低。
2.2转化抗性基因
2.2.1转化抗除草剂基因。目前利用转基因技术已经培育出许多抗除草剂的油菜品种，主要利用的基因为Bar基因[16]、Pat基因和aroA基因[17]等。Miki报道[18]在Arabidopsis中克隆出Ahyclroxyacid合成酶基因（AHAS）突变体，并将其导入油菜，使油菜产生对咪唑基除草剂的抗性。Kumar等[19]将pat基因导入westar、Excel及Tops等品种并获得了抗Glufosinateammonium的转化植株，在70个T1材料中发现有34个T1材料为纯合体，另外36个材料则为杂合体。
2.2.2转化抗病虫基因。危害油菜的主要昆虫是BAW、CBL、DBM。现在主要利用从苏云金杆菌中分离的杀虫晶体蛋白基因（Bt）通过农杆菌介导转化导入油菜。侯丙凯等将抗虫基因转入甘蓝油菜获得转基因抗虫植株。林良斌研究转Bt油菜表明，Bt基因在3~9叶间表达稳定且高效，其中每25g鲜叶中的Bt蛋白表达量为170～260ng，占可溶性总蛋白的0.067%～0.105%，但至11叶下降为0.003%～0.020%，表达量仅为7～50ng。几丁质酶可以催化甲壳质的水解，而甲壳质是构成多数真菌细胞壁的组成成分。中国科学院遗传研究所和微生物研究所将芜青花叶病毒外壳基因转化到甘蓝型油菜中，得到抗病毒的转基因植株。Kazan等[20]将ShpxbaDNA导入Wextar，转基因第2代和第3代抗黑胫病的能力比对照增强了25%～30%，而且体内过氧化酶活性比对照提高了2～3倍。
3转化方法
3.1生物介质介导的遗传转化
目前应用的生物介质主要是根癌农杆菌和发根农杆菌。它们转化的原理分别是通过活化Ti和Ri质粒的Vir区基因，达到对T-DNA转移的目的。在油菜中约有80%的遗传转化是由根癌农杆菌介导转化的[21]，外植体与农杆菌的共培养是获得转化植株的主要途径[22]。目前，已经成功地利用该法将外源基因导入油菜的下胚轴、子叶柄、子叶、原生质体、小孢子中，并得到了转基因植株[23]。例如程振东等利用根癌农杆菌介导法已经把nptⅡ和gus基因导入油菜栽培品种云北2号中，获得了转基因植株。Boulter等认为根癌农杆菌转化频率比发根农杆菌转化频率高，并能直接从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组，是目前较理想的转化系统。
由于不同品种或同一品种的不同器官或组织的再生能力不同，因此利用农杆菌进行遗传转化之前，首先要对不同的外植体建立相应的高效再生体系。张承妹等[24]认为取材时采用子叶柄长度为刚好出现真叶生长点时的长度，从2片子叶结合部剪断并剥开2片子叶，这样有利于芽的分化。高浓度的BA（4.5mg/L）可提高子叶外植体再生或转化效率。Moloney[25]建立了一种农杆菌介导的高效转化方法。认为子叶柄切面的薄壁细胞具有高效再生能力，且很容易受农杆菌感染。程正东认为羧苄青霉素可以促进芽的再生而抑制根的生长。
3.2PEG法
PEG介导法由Davey等和Krens等首先建立，主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA。Rasmussen等[26]通过PEG介导法将Gus基因导入油菜line的原生质体，研究认为PEG浓度是影响转化效率的关键因素，以25%为最佳，并且在加各种物质时，首先加原生质体和DNA，而后再加PEG，但是PEG也不应加得太迟，以2min后加入最宜。Parihar等[27]研究PEG介导法指出，用CaCl2处理原生质体及低剂量的紫外线处理同样可以提高DNA的摄取和外源基因的表达。
3.3激光微束穿刺法
激光微束穿刺法就是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。早在1987年，Weber等[28]就利用微束激光照射油菜细胞，将荧光素标记的外源DNA导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对细胞的分裂能力和叶绿体的光合能力影响较小。由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在油菜遗传转化中的应用与发展。张海燕等[29，30]利用激光微束穿刺法将商陆（Phytolacca）抗病毒蛋白基因导入油菜“双低”品种H165，获得了转基因植株。经抗性鉴定表明，转基因植株对芜菁花叶病的抵抗能力增加。陈军等[31]利用激光微束穿刺法转化油菜小孢子，将包含TuMV外壳蛋白基因的植物表达载体pBTu导入小孢子中，经培养获得抗病毒转基因植株。杨仲毅等[32]用此方法转化油菜品种H165，将菜豆几丁质酶基因导入其子叶叶柄，经卡那霉素筛选和PCR、Southern杂交分析检测，证实获得了转基因植株。这些研究表明，激光微束穿刺法已走向实用化。
激光微束穿刺法操作简便，对细胞的损伤小，可以准确定位于被照射的细胞，实验重复性好，已成为一种行之有效的转基因手段。但与农杆菌介导法相比，激光微束穿刺法转化效率较低，且激光微束仪设备复杂，造价昂贵，因此限制了此技术的推广普及。
3.4基因枪法
基因枪法是利用高压作用将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织，使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中，从而达到稳定遗传和表达的目的。陈正华[33]用基因枪轰击法将苏云金芽孢菌杀虫蛋白基因转入油菜，在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合。熊兴华等认为在培养基中少加卡那霉素，并对子叶柄进行预培养，可以提高基因枪向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因，使转基因植株出苗成功率大大提高。该法对受体材料、靶细胞来源基本不受限制，如细胞、组织、器官等均可作为受体来进行转化，它为基因转移提供了便利条件，其缺点就是转化效率不高，轰击过程中可能造成外源基因的断裂，且价格昂贵。
3.5电击法
电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入，此法在动物细胞中应用较早，并取得了很好的效果。现在这一方法已被广泛应用于各种植物，例如Guerche等[34]用纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体，悬浮于1mL 1mol/LKCl缓冲液中，加入10μg的质粒pABDIDNA（该质粒中含有卡那霉素抗性基因nptⅡ），放入电击仪中电击。他们共处理了4×106个原生质体，用巴龙霉素和卡那霉素筛选得到了21个抗性克隆，并最终获得了2株转化植株，其形态和育性完全正常。与对照相比，转基因植株抗卡那霉素的能力显著提高，对照株在40mg/L卡那霉素的条件下就完全丧失生根能力；而转基因植株在200mg/L卡那霉素的条件下才丧失生根能力，并且抗性可遗传给子代。
3.6其他方法
目前油菜基因工程中除了运用上述方法外，还有一些其他方法，如脂质体法、显微注射法等。脂质体法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合，从而达到转基因的目的；显微注射法是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。这些方法各有其优缺点及适用范围，在油菜育种中运用较少，而在其他作物上有成功的报道。
4转基因油菜的安全性分析
近年来，随着转基因植物的商品化进程加快，有关转基因植物的安全性问题已成为人们研究和关注的热点[35]。转基因植物的安全性主要包括食品安全性和环境安全性两个方面。前者是指人们食用转基因食品后，尽管其中的绝大部分DNA已降解，并在肠胃中失活，但极小部分（0.1%）是否会有安全性的问题。转基因所使用的抗生素抗性筛选基因对人体健康可能造成的不利影响，例如是否会水平转移至肠道微生物或上皮细胞，从而降低抗生素在临床治疗中的有效性等等。目前人们的倾向是这些可能性都比较小，标记基因导致治病时抗生素不起作用的风险也可以忽略不计[36]。转基因的环境安全性主要指基因漂流或基因扩散，即基因通过花粉受精杂交等途径在种群之间扩散。转基因漂流所带来的风险是多方面的，转基因有可能转移到杂草，产生抗除草剂的超级杂草；或者向其他作物中转移，改变其性状，从而对生态环境和生物多样性具有潜在的危害性[37]。
利用叶绿体转化可以有效地控制由于外源基因扩散而引起的生态风险性。因为在受精过程中，只有花粉细胞核穿过胚珠，花粉的细胞质一般不向后代传递。因此，对大多数植物来说，一旦外源基因插入叶绿体基因组，就不能通过花粉向其他植物中扩散。在油菜中，利用叶绿体转化可以控制外源基因的扩散已得到大田试验的证实。例如Scott和Wilkinson[38]在英国泰晤士河沿岸的34km地区，对叶绿体转基因油菜保持外源基因的情况进行了3年的研究。结果发现，叶绿体转基因油菜扩散外源基因的可能性非常小。
叶绿体转化除可以有效地控制外源基因扩散外，还具有表达量高、原核基因无需修饰改造就能直接表达、便于遗传操作、可以实现定点整合、易于保持纯系、导入的外源基因性状稳定性高、可以避免基因的位置效应和基因沉默、可以同时表达多个基因和降低外源基因产物对细胞的影响等优点[39，40]。因此，叶绿体转化已成为油菜转基因技术的另外一个目标[41]。
5结论与展望
综上所述，油菜遗传转化体系在不断完善，但现有的遗传转化率较低，作为一个实用性强的转化体系应具备简单、快速及高效等特点，这样它才能被应用到更多的油菜品种的研究中。因此，进一步改进转化方法，提高转化效率和转基因植物的安全性，将一些更有应用价值的目的基因导入油菜中，是油菜基因工程今后的研究方向。只要人们善加利用，基因工程技术必将更多地为人类造福。
6参考文献
[1] OOMS G，BAINS A，BURRELL M，et al．Genetic manipulation in cultivars of oilseed rape（BrassicanapusL．）using Agrobacterium tumefaciens [J]．Theor Appl Genet，1985（71）：325-329．
[2] DALE P J，BALL L F．Plant regeneration from cotyledonary explants in a range of Brassica species and genotypes[C]．In：the proceeding of 8th International Rapeseed congress，1991，1122-1127．
[3] 石淑稳，周永明，王新发．影响油菜子叶外植体不定芽高频率再生的因素[J]．西北植物学报，1998，18（4）：477-487．
[4] MOLONEY M M，WALKERJM，SHARMA K K．High efficiency transformation of brassica napus using Agroba cferium vectors[J]．Plant Cell Rep，1989（8）：238-242．
[5] 程振东，卫志明，许智宏．根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生[J]．植物学报，1994，36（9）：657-663．
[6] 赵云，王海燕，王茂林，等．基因型对油菜子叶外植体再生植株的影响[J]．中国油料，1997，19（4）：1-4．
[7] GLIMELIUSk．High grow the rate and regeneration capacity of hypocotyls protoplasts in some Brassicaeae[J]．Physiol Plant，1984（61）：38-44．
[8] 李文彬，陈正华，宋玉华．芥菜型油菜原生质体植株再生的研究[J]．遗传学报，1986，13（3）：184-187．
[9] 陈军．用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究[J]．激光生物学报，1998，7（2）：103-107．
[10] 段英姿，牛应泽，郭世星．油菜基因工程研究进展[J]．中国农学通报，2003，19（5）：92-98．
[11] 周伟军，毛碧增，顾宏辉，等．秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[J]．作物学报，2002，28（3）：369-373．
[12] KOHNO-MURASE J，MURSE M，ICHIKAWA H，et al．Effect of anantisense napin gene of seed storage compounds in transgenic Brassica napus seeds[J]．Plant Mol Biol，1994（26）：1115-1124．
[13] KATAVIC V，FRIESEN W，BARTOND L，et al．Utility of the Arabidopsis FAE1 and yeast SLC1-1 genes for improvements in erucic acid and oil content in rapeseed[J]．Bioch Sco，2000，28（6）：935-937．
[14] VESNA KATAVIC，WINNIE FRIESEN．利用拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因通过生物技术提高油菜芥酸含量的尝试[J]．国外作物育种，2001，20（4）：37-44．
[15] 官春云，李恂．转基因油菜应用研究[J]．细胞生物学杂志，1997，19（1）：18-23．
[16] 林良斌．Bt毒蛋白基因转化甘蓝型油菜的研究[D]．长沙：湖南农业大学，1997．
[17] DALEY M．Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants[J]．Plant Cell Reports，1998（17）：489-496．
[18] 孙万仓．转基因研究进展[J]．西北农业学报，2000，9（3）：117-121．
[19] KUMAR A，RAKOW G，DOWNEY R K．Genetic characterization of glufosinate-ammonium toleranl summer rape lines[J]．Crop Sci，1998（38）：1489-1494．
[20] KAZAN K，GOULTER K C，WAY H M，et al．Expression of a pathogenesis-ratated peroxidase of stylosanthes humilis in transgenic tobacco and canola and its effect on disease development[J]．Plant Sci，1998（136）：207-217．
[21] 闫新甫．转基因植物[M]．北京：科学出版社，2003．
[22] 林忠平．走向21世纪的植物分子生物学[M]．北京：科学出版社，2000．
[23] 李洪清，李美茹．影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题[J]．植物生理学通讯，1999，35（2）：145-151．
[24] 张承妹，钱柄俊，张大兵，等．利用高效农杆菌遗传转化系统将ACP反义基因片段导入油菜[J]．上海农业科学，2003，19（2）：5-8．
[25] MOLONEY T A，WOORREL ACETAL．Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants[J]．Science，1992（257）：72-74．
[26] RASMUSSEN J O，RASMUSSEN O S．PEG mediated DNA uptake and transient Gus expression in carrot，rapeseed and soybean protoplants[J]．Plant Sci，1993（89）：199-207．
（下转第108页）
（上接第106页）
[27] PARIHAR D S，MAHESHWARI S C，PARAMJIT K，et al．Influence of heat shock and uvirradiation on PEG-mediated DNA uptake and transient expression of NPTⅡgene in protoplasts of Brassicanapas[J]．IndianJ of Expbio，1998，36（10）：1002-1006．
[28] WEBER G，MONAJEMBASHI S，GREULICH K O．Uptake of DNA in chloroplasts of Brassica napus bymeans of a micro-focused laser beam[J]．EurJ Cell Biol，1987（43）：63-65．
[29] 张海燕，田颖川．将商陆抗病毒蛋白（PAP）cDNA导入油菜获得抗病毒转基因植株[J]．科学通报，1998，43（23）：2534-2537．
[30] 张海燕，党本元．用激光微束穿刺法将PAPcDNA导入油菜获得抗病毒转基因植株[J]．中国激光，1999，26（11）：1053-1056．
[31] 陈军，王兰岚，刘澄清，等．用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究[J]．激光生物学报，1998，7（2）：103-107．
[32] 杨仲毅，王兰岚．利用微束激光穿刺法将菜豆几丁质酶基因导入油菜的研究[J]．激光生物学报，1999，8（1）：8-11．
[33] 侯丙凯，陈正华．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究[J]．遗传，2001，23（1）：39-40．
[34] GUERCHE P，CHARBONNIER M，JOUANIN L．Direct gene transfer by electroporation in Brassica napus[J]．Plant Sci，1987（52）：111-116．
[35] JAN-PETER N，PETER L J M，MARGA E，et al．The release of genetically modified cropsinto the environment[J]．The Plant Journal，2003（33）：1-18．
[36] 冯英，薛庆中．作物抗虫基因工程及其安全性[J]．遗传，2001，23（6）：571-576．
[37] 吴志平，徐步进．转基因植物释放后在环境中成为杂草的风险性[J]．生物工程进展，1999，19（1）：9-13．
[38] SCOTT S E，WILKINSON M J．Risks of transgene escape from transplastomic oilseed rape[J]．Nature Biotech，1999（17）：390-392．
[39] 候丙凯，陈正华．高等植物的质体基因转化[J]．生物工程进展，2000，20（1）：70-73．
[40] 范国昌，张中林，沈桂芳．叶绿体遗传转化的研究[J]．细胞生物学杂志，1998，20（4）：169-174．
[41] HENRY D．Molecular strategies for gene containment in transgenic crops[J]．Nature Biotechnology，2002（20）：581-586．
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