摘要：目的寻找简单、可靠、经济准确的检测巨噬细胞中Line-1 甲基化水平的实验方法。方法体外培养单核细胞源性巨噬细胞，不同浓度Hcy作用后以甲基化特异性PCR检测Line-1 DNA甲基化水平变化后，分别克隆扩增相应的片段，将不同浓度稀释的甲基化和非甲基化样品分别加入到荧光PCR体系中，按照荧光PCR体系进行操作，检测其荧光表达，根据相应的稀释倍数与扩增数做出相应的标准曲线。结果各Hcy浓度组的Line-1 DNA甲基化程度随Hcy浓度的增高甲基化程度升高，Line-1 DNA甲基化程度与对照组比较，分别上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，差异有统计学意义(P<0.05)；分别得到Line-1 DNA甲基化标准曲线：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化标准曲线：Y=-2.7406x+36.208。结论Line-1 DNA甲基化与Hcy介导的动脉粥样硬化关系密切，荧光定量PCR法建立的标准曲线是检测Line-1 DNA甲基化水平的一种方便且准确的方法。
关键词：LINE-1；巨噬细胞；同型半胱氨酸；DNA甲基化；荧光定量PCR
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病重要的基础性病变，在AS形成过程中，单核细胞在相关危险因子的作用下转化为巨噬细胞，巨噬细胞细胞的形成是AS主要病理特征之一。同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是AS的独立危险因子[1]，同时有报道指出Hcy可以改变巨噬细胞中保守序列Line-1 DNA甲基化水平从而影响其表达，并由此进一步导致了AS的发生。目前检测甲基化水平的方法很多，但大多属于定性或半定量方法，且在Hcy介导巨噬细胞致AS中Line-1 DNA甲基化水平变化目前人们关注较少，检测方法单一、不准确。本文旨在通过观察Hcy对THP-1单核细胞源性巨噬细胞形成中Line-1 DNA甲基化水平的改变，建立一种新型、高效方便且准确可行的检测DNA甲基化的新方法。
1资料与方法
1.1一般资料干粉末RPMI-1640培养基(GIBCO.BKI公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)；Hcy、L-多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺、佛波酯(PMA)(Sigma公司)；THP-1单核细胞株(四川大学华西医学院)、DNA甲基化检测试剂盒(赛默公司)、DNA提取试剂盒(promage 公司)。
1.2仪器相差显微镜(日本Nikon公司产品)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；全自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安YXQ-LS50A)；微量台式离心机(Eppendorf)；CO2孵箱(Heraeus, Germany)；Model680全自动酶标仪(Bio-rad，America)等。
1.3方法
1.3.1 THP-1单核细胞的培养、泡沫细胞形成和鉴定取液氮中冻存的THP-1单核细胞株，37℃水浴，完全溶解后加适量RPMI-1640培养基，弃上清，加入PMA使其终浓度为500 mol/l，显微镜下观察，证实THP-1细胞已分化为巨噬细胞，更换含不同浓度的Hcy RPMI-1640培养基培养24h。
1.3.2 DNA抽提使用promega DNA提取试剂盒，按说明书进行具体操作。
1.3.3 Line-1DNA甲基化水平检测设计甲基化和非甲基化上、下游引物。扩增反应后取产物2μL在2%的琼脂糖凝胶中100V 电泳30min，紫外线照像分析光密度。
1.3.4从琼脂糖凝胶中回收DNA①通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中（要尽可能使用长波长紫外光判定DNA片段的位置）。②纯化回收DNA：采用天根生化科技（北京）有限公司的DNA纯化回收试剂盒。按照试剂盒的操作说明书进行。
1.3.5 Real-Time PCR建立 LINE- 1DNA甲基化标准曲线①分别将质粒M和质粒U稀释102倍、103倍、104倍、105倍，作为Real-Time PCR 的模板。②反应条件：95℃预变性2min，一个循环；95℃变性30s， 72℃延伸30 s，40个循环。③Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得位置样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.4统计学分析采用SPSS 12.0 分析，数据以均数±标准差(x±s)表示。两样本均数间比较采用Student"s t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1巨噬细胞模型的建立THP-1单核细胞经PMA诱导48h后在显微镜下观察此时细胞呈贴壁状态,可见形状不规则并有伪足伸出的巨噬细胞,见图1。
图1 巨噬细胞(400×)
2.2巢式降落式PCR检测各组巨噬细胞中Line-1 DNA甲基化的变化nMS-PCR法检测Line-1 DNA甲基化表明，不同浓度的Hcy处理细胞后，各Hcy浓度组的Line-1 DNA甲基化程度随Hcy浓度的增高甲基化程度升高,Line-1 DNA甲基化程度与对照组比较,分别上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，有统计学差异(P<0.05),其中500μmol/L组差异有显著统计学意义(P<0.01)(见图2),说明Hcy可升高Line-1 DNA甲基化程度。
图2Hcy对巨噬细胞中Line-1基因甲基化修饰状态的影响
*P<0.05,**P<0.01,与control组相比较。
2.3 Line-1 DNA甲基化和非甲基化标准曲线的建立将不同浓度稀释的甲基化和非甲基化样品分别加入到荧光PCR体系中，按照荧光PCR体系进行操作。根据不同稀释倍数所对应的不同Ct值便可得到相应的回归方程式，即：Line-1 DNA甲基化标准曲线：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化标准曲线：Y=-2.7406x+36.208,见图3。
3讨论
动脉粥样硬化是一种严重危害人类身体健康的常见病、多发病。Hcy已被公认为是致AS的一个主要独立危险因子，已报道的Hcy致AS的主要机制包括：促进氧化应激、凋亡、炎症，干扰NO系统的功能等[2]。在AS形成过程中，巨噬细胞细胞的活化、脂质吞噬及分泌功能的改变是AS形成的重要机制，因此,研究这些细胞功能的改变及其机制，是阐明AS形成分子机制的重要环节。
Line-1 序列中CpG二核苷酸含量丰富， CpG 是基因组甲基化的主要底物，这为人类基因组提供了甲基化的位点，而甲基化/去甲基化可以调节基因的表达，进而影响疾病的发生发展[3]。本研究中，课题组在成功复制THP-1单核细胞源性巨噬细胞的基础上，以不同浓度Hcy作用巨噬细胞后，分别检测了各组细胞中Line-1 DNA甲基化水平的改变，同时证实：Hcy对于巨噬细胞中Line-1 DNA甲基化水平改变有影响，并存在一定的剂量依赖关系，说明在Hcy致AS中Line-1 DNA甲基化作用显著。课题组分别利用体外克隆技术和蓝白斑筛选技术将甲基化和非甲基化的片段产物链接到T载体上，扩增后将提取的质粒按一定的倍数稀释。按着荧光PCR的体系进行扩增，并将不同的Ct值按对应得稀释倍数做出回归方程，得到不同的标准曲线。虽然目前甲基化的检测方法很多，但大体可分成两类， 亚硫酸氢盐修饰和甲基化敏感性限制性酶切，然后结合一些检测方法如PCR，或核酸杂交，或琼脂糖凝胶电泳等。结合亚硫酸氢盐修饰的一些研究DNA 甲基化的方法比较常见[4]，如MSP 法是靠引物来识别甲基化位点的，修饰后用普通PCR 进行定性观察，或用定量PCR 提高实验的精确度，方法中每条引物必须覆盖3 个以上的CpG 位点，且这些位点需要同时甲基化或同时去甲基化才能分别被M 引物或U 引物识别并扩增[5]；本研究将甲基化敏感性限制性酶切与定量PCR 相结合，用于检测Line-1 DNA甲基化水平。该方法虽不及甲基化基因芯片或全基因组甲基化测序等获得的信息多，但是本方法简便易行，花费远远小于基因芯片或全基因组测序，适合大批量如临床标本的检测。本方法简单易行、可操作性强、检测范围广，因此更易于推广。
用标注曲线法检测Line-1 某一个或某几个CpG 位点在AS这种"慢性肿瘤"中的甲基化水平或许能找到预测早期的分子标志物，当然，这需要在未来开展大量的工作和深入而广泛的研究。
参考文献：
[1]杨永宗.动脉粥样硬化性心血管病基础与临床[M].科学出版社.
[2]柏庆利.动脉粥样硬化的独立危险因素:同型半胱氨酸和黏附分子相关性研究[J].中国临床康复,2003,7(24):3286-3287.
[3]Y Quentin. A master sequence related to a free left Alu monomer (FLAM) at the origin of the B1 family in rodent genomes [J]. Nucleic Acids Research, 1994, 22: 2222-2227.
[4]Li LC． Designing PCR primer for DNA methylation mapping[J].Methods Mol Biol，2007，402：371－384.
[5]Shames DS，Minna JD，Gazdar AF． Methods for detecting DNA methylation in tumors：from bench to bedside ［J］．Cancer Lett，2007，251（2）：187－198.
编辑/申磊
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