抗肿瘤化合物告达亭的早期毒性机制研究

材料与方法

1.1 药品与仪器

告达亭购于深圳美荷生物公司，戊巴比妥纳、苦味酸、乙二胺四乙酸（K2-EDTA）等为上海生工的进口分装试剂.所用仪器有五分类血液细胞分析仪BC-5500（Mindray 公司），倒置顯微镜CX-41（Zeiss公司）等.

1.2 实验动物

SPF级6周龄雄性昆明鼠30只，健康状况良好，体质量为35～40 g，购自斯莱克景达实验动物中心.

1.3 动物分组及告达亭剂量

将30只雄性昆明鼠随机分为6组，每组5只，用全价颗粒饲料喂养，自由饮水，培养环境为SPF级动物房，室温：22～24 ℃，湿度：50%～64%.实验重复两次，每次15只小鼠，分3组.于每日上午8～9时分别以5和10 mg/kg及等容量溶剂腹腔注射，对照组所注射的溶剂为丙二醇和PEG400按照体积比1∶9 配制，再用水稀释至总体积占比20%，过滤灭菌.

1.4 观察指标

1.4.1 行为观察及体重检测 每天进行一般观察的项目，包括小鼠精神状态、行为活动、粪便性状、腺体分泌、皮肤被毛等.隔日称取体质量，进行监测.

1.4.2 血清生化指标的检测 末次给药24 h后，对小鼠腹腔注射1%戊巴比妥纳进行麻醉，所有小鼠均用眼眶下采血法收取血液，先取1.5 mL血液样本按照1∶100 的比例加入10% K2-EDTA 抗凝剂.取2 mL血液样本，自然凝固后，检测肌酐（CREA）、胆固醇（CHOL）、总蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、尿酸（UA）等血清生化指标.检测血液学指标包括红细胞（RBC）、血红蛋白含量（HGB）、红细胞容积（HCT）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞分布宽度标准差（RDW-SD）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、白细胞数（WBC）、血小板压积（PCT）、血小板数（PLT）、血小板平均体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）.

1.5 病理学检查

用颈椎拉断法处死小鼠后尸解，取出心、肝、肺、肾和睾丸5个脏器组织，首先经 Bouin氏液固定24 h，在自来水下流水冲洗10 min.用70%，80%，90%，95%，100%各级酒精梯度脱水，每级10～30 min.用二甲苯将材料进行透明，每次20～30 min，进行2次.浸蜡，包埋后保存.经切片、展片与贴片，脱蜡，染色，脱水，透明，封片，镜下观察并拍照[7-8].

2 结果

2.1 告达亭对雄性小鼠的影响

雄性昆明小鼠在给药前经SPF级动物房适应性饲养7 d，经为期14 d告达亭给药处理，每次给药后未见小鼠口、鼻、眼有异常分泌物.14 d 后所有小鼠行为活动正常，精神状态良好、毛发光润，未见粪便异常，无一例死亡.

2.2 告达亭对雄性小鼠体质量增长的影响

体质量增长的幅度可以反映动物机体发育是否正常，通常通过检测实验组和对照组动物的体质量变化，来观察是否存在药物毒性[9].正常情况下，6周龄小鼠的体质量会逐日增长，若小鼠患有某些疾病，则体质量增长会受到影响.每隔一天的相同时间为实验鼠称体质量，计算平均值.统计结果见图2，与溶剂对照组比较，5 mg/kg告达亭处理组体质量增长较快，10 mg/kg 告达亭剂量处理组的体质量增长速率基本一致，结果表明告达亭对小鼠的体质量无明显抑制作用.

2.3 告达亭对雄性小鼠血液学指标的影响

对雄性昆明小鼠连续腹腔注射给药14 d，末次给药24 h后，眼球取血检测各项血液学指标.血液中各种指标的增高或降低都与机体的健康状态息息相关，主要血液指标见表1.结果显示，低剂量组白细胞（WBC）计数与同期溶剂对照组比较略有降低，高剂量组WBC计数与对照组比较下降明显.白细胞的多少与身体免疫能力息息相关，可见告达亭在一定程度上降低了身体的免疫能力.其他组各项指标与同期溶剂对照组比较，中剂量组和高剂量组都没有显著性差异.统计结果如图3.

2.4 告达亭对雄性小鼠血清生化指标的影响

各组动物血清生化指标见表2，告达亭处理组与溶剂对照组比较，CREA（肌酐）、TP（总蛋白）和UA（尿酸）的检测结果均无明显影响.TG（甘油三酯）和CHOL（胆固醇）在告达亭低浓度组略有升高，在高浓度组又下降.统计结果见图4.

2.5 告达亭不影响雄性小鼠组织器官的发育

采取常规脱颈椎法处死实验鼠，解剖并仔细观察各主要脏器，未见脏器萎缩、坏死等异常现象.采用常规石蜡切片，然后对各组织伊红染色，苏木精复染，树胶封片，镜检.结果如图5所示.肺、睾丸、肾脏、心脏和肝脏组织中均未发现病灶情况.各组肺部结构清晰，细胞核质分布明显；睾丸是机体的生殖和内分泌器官，对照组以及5和10 mg/kg告达亭剂量处理组中小鼠睾丸的结构正常.曲细精管管腔内细胞层数未见减少，各级生精细胞排列规则、层数多，曲细精管管腔内充满较多精子，间质细胞成群分布；与对照组比较，5和10 mg/kg告达亭剂量处理组肾脏组织结构完整，肾小球和肾小管轮廓清晰，未见异常现象；心脏为循环系统中一个主要的器官，心内膜切片结果显示，与对照组比较，内皮下层的结缔组织较为致密，无结构异常.告达亭剂量组与溶剂对照组相比，肝组织结构完好，可见肝小叶和汇管区，无异常变化.

3 讨论

药物研发环节中需要进行毒理学研究，淘汰因毒性问题不适宜进一步研发的中药或合成化合物，有助于降低投资风险、提高研发成功率.耳叶牛皮消分布广泛，药用块根具有养阴清热、止咳、抗炎等功效.但它因为含耳叶牛皮消根萝蘑毒素（cynanchotoxin），食用后出现的中毒症状有流涎、呕吐、痉挛、呼吸困难、心跳缓慢等.告达亭是从耳叶牛皮消中提取出的一种C21甾体化合物，初步药效学证实它可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，具有良好的应用前景[10].告达亭作为耳叶牛皮消的一种衍生物，其一般毒性、毒性作用靶器官、毒性作用机制均未开展系统研究.

六周龄雄性小鼠购买后，经适应性饲养7 d，称取体质量，发现差别不大.随机将小鼠分成3组， 14 d连续小鼠尾静脉注射告达亭，注射剂量分别按0，5和10 mg/kg.14天后观察，3组动物全部存活，精神和运动未见异常；对照组与高剂量告达亭实验组小鼠平均体质量增长无明显差异，表明此浓度范围内的告达亭对体质量增长无抑制作用；低剂量告达亭实验组与对照组比较平均体质量有小幅增加，说明低剂量告达亭可以促进消化和吸收食物，有利于体质量增长.血液学检查RBC，HGB，HCT和RDW等发现，与同期溶剂对照组比较，低剂量组和高剂量组都没有显著性差异，变化在正常参考值范围内.低剂量组WBC计数与对照组比较略有降低，但在正常参考值范围内，而告达亭高剂量组WBC计数与同期溶剂对照组比较有显著性降低.白细胞减少与感染、毒素或药物引发有关.告达亭是否会引起白细胞持续下降，是否引起动物乏力、食欲减退，毒性程度是否严重，将通过延长给药时间、增加给药剂量等实验来证明.血浆生化指标检查发现，和肝功能代谢能力相关的TP，与肾功能相关的CREA和UA，以及血脂分析的常规项目TG和CHOL均未见明显改变.进一步观察HE染色的組织切片发现各组器官均正常.高剂量组和低剂量组告达亭处理后的小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索和肝血窦均没有变形，大小比例正常.告达亭处理组的肾小球剖面界限清晰，肾小管和间质未见明显异常.近年来研究发现，生殖细胞对药物更敏感，抗肿瘤药物有效杀死肿瘤细胞的同时，往往引起生精细胞的大量凋亡，甚至男性生精功能急剧下降，从而导致不育.两组告达亭处理组的睾丸曲细精管形状正常，每一个曲细精管内均见多层细胞，生精细胞与支持细胞数目丰富，管腔从外向内有各级生精细胞排列规则，最内层精子形态和数量正常.药物组未见小鼠心肌萎缩、心肌断裂、心肌出血，心肌细胞核完整.两组告达亭处理组的肺组织是正常网状结构，苏木精复染后，细胞核清晰可见，胞核与胞浆对比鲜明，从组织形态未看出病变.综上实验结果说明，一定浓度的告达亭对小鼠血液系统以及肝、肾、睾丸、心和肺等重要器官的毒性作用很小.

在药物的毒性反应中还须考虑神经毒性.药物产生的神经毒性会引起神经系统的不良反应，有可能造成包括药物成瘾在内的诸多不良后果.据统计，大约有10%的新药因为神经系统不良反应而不能面市[11-13].因此下一步将着重研究告达亭是否会产生神经毒性，并研究告达亭对雌性小鼠有无生殖毒性.另外，遗传毒理学也是目前新兴的一项毒理实验研究学，笔者想从中药抗诱变性的角度研究告达亭是否起中药抗诱变性作用，能否与其他成熟的化疗药物配合使用，降低化疗药物的剂量，达到更好的治疗效果.

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