术中快速冰冻切片环保封片剂封片效果的探讨

材料与方法

1.1 实验材料

赛默飞世尔（中国）有限公司生产的冰冻切片机;赛默飞世尔（中国）有限公司生产的苏木素、伊红染液各500 mL;赛默飞世尔（中国）有限公司生产的NEG-50 OTC胶1瓶;无锡市江原实业技贸总公司生产的Mounting Medium环保封片剂50 mL;国药集团化学试剂有限公司生产的中性树胶100 g;上海久亿化学试剂有限公司生产的分析纯二甲苯1500 mL;上海久亿化学试剂有限公司生产的95%乙醇100 mL、冰醋酸10 mL;江苏世泰实验器材有限公司制造的病理级显微镜载玻片6盒（浮法玻璃、高清潔度、规格：25 mm×75 mm、厚度：1～1.2 mm）;江苏世泰实验器材有限公司制造的高品质显微镜盖玻片300片（超白玻璃、规格：24 mm×24 mm;厚度：0.13～0.16 mm）;一次性尿杯12个;10 mL一次性塑料滴管20支。

1.2 方法

1.2.1 固定液及封片液的配制  （1）乙醇-冰醋酸固定液配制：95%乙醇100 mL滴加3～5滴冰醋酸，充分搅匀，待用[4];（2）不同浓度中性树胶封片液制备：将一次性尿杯擦拭干净;分别编1～12号，每杯加5 mL中性树胶。第一杯加入0.1 mL二甲苯，第2～12杯每杯依次增加0.1 mL二甲苯，至第12杯内注入1.2 mL二甲苯。将配好的中性树胶充分搅匀，待用[4]。

1.2.2 快速冰冻组织切片的制备  将送检新鲜标本切割成2 cm×1.7 cm×0.2 cm组织块，于冷冻台上滴加少量OTC胶，迅速将组织块粘附其上，于组织上滴加适量OTC胶，将冰冻切片机温度调制-25℃加速冷冻[5]，待组织块冷冻变硬后固定于切片台上，先粗修待组织完整暴露后进行5 μm连续切片，将组织片粘附于载玻片上，立即置入乙醇-冰醋酸固定液中，1 min后取出[4，6]。

1.2.3 冰冻切片HE染色  （1）蒸馏水中1 min;（2）苏木素染液染色5～10 min;（3）流水洗去苏木素染液1 min;（4）1%盐酸-乙醇分化液中放置1～3 s;（5）流水冲洗1～2 s;（6）在1%的氨水中返蓝5～10 s;（7）流水冲洗2～4 min;（8）0.5%伊红染液染色1～3 min;（9）蒸馏水洗1～2 s;（10）80%乙醇中放置1～2 s;（11）分别于第一、二缸95%乙醇中放置2～3 min;（12）分别于第一、二、三缸无水乙醇中放置3～5 min;（13）分别于第一、二、三缸二甲苯中放置3～5 min[4]。

1.2.4 冰冻组织切片的封固  由同一名技术熟练的病理技师采用同一种手工封片方法，分别从1～12杯中用每杯专用的滴管吸取适量封片液，滴加于组织切片上，最后加盖盖玻片，每种浓度的封片液分别封固20张切片。再用Mounting Medium环保封片剂封固20张切片。

1.3 结果判读

由两名中级以上病理医师采用双盲法观察封固后切片中气泡的数量，按照是否存在气泡及气泡的数量进行分组统计，当观察结果有差异时以最高值为准。采用王灿等[2]的评判标准进行评估：（-）为无气泡;（+）为少量气泡，每片气泡≤5个;（++）为中等量气泡，5个<每片气泡≤10个;（+++）为大量气泡，每片气泡>10个。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS19.0统计软件分析，计数资料以[n（%）]表示，采用四格表资料的χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度二甲苯中性树胶封片液封片时气泡产生率比较

研究发现1～3及7～11号封片液所封片气泡数量多而明显;4～6号封片液所封片气泡量少，其中气泡量最少的为4号（加入0.4 mL二甲苯）;12号封片液所封片气泡量介于前二者之间（表1）。再对每组间气泡产生率的差异进行统计学分析。12与9、11号之间气泡产生率的差异无统计学意义（χ2=1.129，P=0.288）;12与2、3、10号之间气泡产生率的差异无统计学意义（χ2=2.133，P=0.144）;12与7、8号之间气泡产生率的差异无统计学意义（χ2=3.584，P=0.058）;12与1号之间气泡产生率的差异有统计学意义（χ2=5.625，P=0.018）（表2）。4与5、6号之间气泡产生率的差异无统计学意义（χ2=0.173，P=0.677）;4与12号之间气泡产生率的差异有统计学意义（χ2=10.417，P=0.001）（表3）。可见，中性树胶与二甲苯最佳的配比度为12.5：1（5 mL：0.4 mL），此时封片产生的气泡量最少、效果最佳。

2.2 环保封片剂与0.4 mL二甲苯中性树胶封片液封片时气泡产生率比较

环保封片剂与0.4 mL二甲苯中性树胶封片液之间气泡产生率的差异无统计学意义（χ2=1.290，P=0.256）。见表4。

3 讨论

手术中快速冰冻检查是手术医师在实施手术过程中向病理医师发起的急会诊，主要针对病变良恶性的快速判断，快速冰冻结果往往决定着手术方案的选择，优良的制片是准确诊断的前提[7]，作者通过2018年全年本科室切片质控，发现切片封固时产生的气泡数量是影响冰冻切片质量的重要因素之一[8]。作者发现，快速冰冻切片封固时，中性树胶和二甲苯的配比浓度至关重要，否则易产生外溢或气泡[9]，封片的中性树胶浓度要适中，过稀易产生大气泡，封片液外溢污染切片;过稠厚易出现厚薄不均，折光差并产生细小气泡，这与文献中的报道一致[2]，然而二甲苯易挥发，配制的二甲苯中性树胶封片液很难维持在固定的配比，同时封片液浓度也受室温变化的影响较大，因此工作中经常需要频繁更换;此外，二甲苯作为中性树胶稀释液有较强的刺激气味和毒性，因此有必要采用一种不易挥发、性质稳定、无毒无害的环保封片剂作为传统二甲苯中性树胶封片液的替代品[10]，本文作者单位采购了新型Mounting Medium环保封片剂，理化性质均符合替代品的要求，但在冰冻切片封固过程中对气泡数量的影响方面，与中性树胶封片液之间的差异有无统计学意义，能否作为后者的良好替代品，尚需实验进一步证实。

首先，对冰冻切片封片时最佳中性树胶浓度进行探讨。表1中的数据主要分为三组，第一组为1～3、7～11号封片液，其间封片气泡产生率较接近;第二组为4～6号封片液，其间封片气泡产生率相接近;第三组为第12号封片液，封片气泡产生率介于前两组之间。因此，作者分别将第一组、第二组的封片气泡产生率与第三组进行对比，通过一、三组间比较发现，在对切片气泡量影响方面，12号与2、3、7～11号封片液间差异无统计学意义，而与1号封片液间差异有统计学意义，即在5 mL中性树胶中分别滴加入0.2、0.3、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL二甲苯进行稀释后，对封片时气泡产生量的影响是相同的，而加入0.1 mL二甲苯稀释后的封片液则会较以上各组封片液产生更多气泡;对比二、三组后发现，在对切片气泡量影响方面，4号与5、6号封片液间差异无统计学意义，而与12号封片液间差异有统计学意义，即在5 mL中性树胶中分别滴加入0.4、0.5、0.6 mL二甲苯进行稀释后，对封片时气泡产生量的影响是相同的，并且0.4 mL组封片液封片的气泡产生率、大气泡产生率均最低，而加入1.2 mL二甲苯稀释后的封片液则会较以上各组封片液产生更多气泡。由此可见，快速冰冻切片封片中，中性树胶与二甲苯最佳的配比度为12.5：1（5 mL：0.4 mL），此时封片产生的气泡最少、效果最佳，极大的提高了切片观察的清晰度，避免了因影响切片观察而造成的诊断困难;当二者配比度高于50：1（5 mL：0.1 mL）时，封片时产生的气泡量显著增加，封片合格率最低，将会严重影响冰冻切片的质量，导致病理医师观察困难，甚至无法诊断，应当避免;而当二者配比度介于4～7∶1[5 mL：（0.7～1.2 mL）]或17～25：1[5 mL：（0.2～0.3）mL]间，封片时亦会产生较多气泡，也应加以避免。

其次，对比分析环保封片剂与最佳封片浓度中性树胶封片液的封片气泡产生率，从而评价前者的封片效果。上述試验已证明，快速冰冻切片封片中，中性树胶与二甲苯最佳的配比度为12.5：1（5 mL：0.4 mL），当用配比度为5 mL：0.4 mL的封片液封固冰冻切片时，封片气泡产生率最低（15%），因此作者选用配比度为5 mL：0.4 mL的二甲苯中性树胶封片液与环保封片剂进行封片气泡产生率对比，发现在对切片气泡量影响方面，环保封片剂与0.4 mL二甲苯中性树胶封片液间差异无统计学意义，即环保封片剂与0.4 mL二甲苯中性树胶封片液，对封片时气泡产生量的影响是相同的。由此可见，采用环保封片剂进行快速冰冻切片封固，产生的气泡量少，清晰度高，很大程度的提高了封片合格率，有助于病理医师的观察和诊断。

综上所述，Mounting Medium环保封片剂可以作为传统二甲苯中性树胶封片液的良好替代品[11，12]，这样既避免了由于二甲苯挥发而造成的传统中性树胶封片液的浓度稳定性差的问题，也预防了二甲苯对工作环境的污染，保证了工作人员的安全;同时减少了技术操作步骤，简化了操作流程，一定程度上避免了部分人为因素的干扰，是一种值得推广的术中快速冰冻切片环保封片剂。

本文试验数据建立于本单位特定的试验环境之下，在不同的实验室之间可能存在一定的差异，比如南、北方气候不同，可能在数据方面会有一定偏差。此外，该研究仅探讨了术中冰冻切片的封固问题，冰冻切片制作流程不同于常规石蜡切片，而且本研究只是针对同一患者同一部位组织进行，由于人体不同组织器官的冰冻切片制作也有一定差异[13-15]，因此，本研究结论是否同时适用于常规石蜡病理切片、细胞学涂片，是否同时适用于人体其它部位的组织，尚需进一步细化分层研究证实。

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（收稿日期：2019-07-09）

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