THP—1分化的巨噬细胞来源Exosomes的生物学特征鉴定

材料与方法

1.1材料

人单核白血病细胞系THP-1来自武汉大学保藏中心。

1.2试剂及仪器

RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hy-clone公司，CD80、ICAM-3、HSP-70抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司、佛波酯（12-邻-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，PMA）购自德国默克公司，Cocktail蛋白酶抑制剂购自长沙海扬生物技术公司、蔗糖、磷钨酸均购白南京金斯瑞生物技术公司。

美国Beckman超速离心机；日本日立透射电子显微镜；美国Forma Scientific CO2细胞培养箱；倒置显微镜（Olympas）；中国六一垂直电泳仪。

1.3 细胞培养

THP—l细胞于含10%胎牛血清的RPMl-1640培养基中，37℃，5% CO2饱和湿度环境中培养48h后，0.1mmol/L PMA诱导THP-1细胞24h，使其分化形成巨噬细胞。

1.4Exosomes收集

收集巨噬细胞上清液，4℃，4000r/min，离心20min，保留上清；4℃，10000r/min，离心45min，保留上清；4℃，32000r/min，离心60min，保留沉淀，9%蔗糖溶液200μL、lOOx蛋白酶抑制剂2μL溶解沉淀；4℃，40000r/min，离心45min保留沉淀，9%蔗糖溶液50μL、lOOx蛋白酶抑制剂lμL溶解沉淀，-80℃保存备用。

1.5Exosome透射电镜鉴定

取10μL新鲜Exosomes溶液，3%磷钨酸染色5min，将Exosomes滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察其形态大小并拍照保存分析Exo-somes提纯质量。

1.6Western blot

Bradford方法测定Exosomes蛋白浓度；配制10%SDS-PAGE电泳凝胶，将变性后的蛋白质按50μg的蛋白质总量上样电泳，然后通过电转移法将蛋白质转至PVDF膜上，以免抗人CD80、I—CAM-3、HSP-70抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗进行免疫反应，凝胶成像系统观察拍照。

2结果

2.1佛波酯（PMA）诱导THP-1分化成巨噬细胞

THP-1细胞培养48h后细胞密集度达80%后的生长情况，THP-1细胞经0.1mmol/LPMA诱导24h后，分化形成梭形巨噬细胞（图1），分化形成的类巨噬细胞具很强的吞噬功能。

2.2透射电镜鉴定Exosomes

10μL新鲜Exosomes溶液，与3%磷钨酸2μl染色5min后，Exosomes溶液轻轻滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察Exosomes形态学特征（图2A），并利用NanoSight统计系统分析Exosomes溶液中囊泡直径大小，并绘制曲线（图2B）。

2.3Exosomes膜蛋白表达

CD80、ICAM-3和HSP-70 3种蛋白质在不同细胞来源的Exosomes上均有表达，目前认为这3种蛋白质可以作为Exosomes的特征蛋白质。Western blot研究分析巨噬细胞分泌的Exosomes膜上CD80、ICAM-3、HSP-70的表达（图3）。

3讨论

近年来，越来越多的实验结果证明：树突状细胞和肿瘤细胞产生的Exosomes具有显著的免疫调节功能，可转运肿瘤抗原至抗原提呈细胞，诱导细胞毒性T-淋巴细胞反应，产生和增强抗原特异性免疫应答；Exosomes的非细胞性及其不易被体内环境诱导丧失活性、无繁殖能力、稳定性高、体积小易清除、储藏时间长等优点，使Exosomes有可能成为一种很有潜力的新型无细胞治疗性肿瘤疫苗。目前法国科学家研究的树突状来源的Exosomes肿瘤疫苗已经进入临床I期，并且尚未发现任何副作用。Bard等研究报道，肿瘤来源的Exosomes亦可诱导有效免疫应答，如恶性渗出物（胸水、腹水）中的Exosomes同样含有肿瘤抗原和抗原提呈分子，可以诱导产生抗肿瘤一细胞反应。

本研究通过佛波酯PMA在体外诱导人单核白血病细胞分化形成巨噬细胞，并通过超速离心法收集巨噬细胞培养上清中微小囊泡。经透射电镜分析表明收集到的95%的微小囊泡物质的直径在30～100nm范围内，从而证明低温超速多步离心法成功收集获得巨噬细胞分泌的Exosomes，该方法可以应用于大批量Exosomes的收集以满足后续实验Exosomes的需求。

根据蛋白质组学的研究分析，Exosomes蛋白成分可以分为3类：提呈相关蛋白质如热休克蛋白、MHC类分子；信号转导相关蛋白质如整合素、膜联蛋白、四跨膜蛋白家族；细胞骨架蛋门如肌动蛋白、微管蛋白，不同细胞来源的Exosomes的蛋白质有一定差别，而脂质成分与质膜的成分相似。Exosomes介导细胞间信息传递主要通过Exosomes表面蛋白复合体与不同细胞表面受体配对，在细胞之间没有直接接触的情况下进行细胞之间的信号传导。本实验采用Western blot方法分析了巨噬细胞来源Exosomes表面的3种特征性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70的表达，实验再次表明Exosomes的蛋白种类丰富，且不同来源Exosomes的蛋白有一定的共同性。本实验的初步研究为后续大规模收集Exosomes及后续免疫动物实验打下了坚实的技术基础。

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