材料与方法
1.1 菌种富集、分离纯化和培养基组成[4]
称取1 g样品放入装有9 mL无菌水的试管中，80 ℃水浴20 min，充分振荡混匀，取1 mL 到下一个同样的试管中，依次稀释得到各种浓度的菌悬液。分别取10-5～10-7 3个稀释梯度的稀释液0.1 mL涂布于NA平板上，然后倒置于培养箱中37 ℃培养24 h。挑取不同形态的单菌落转接至NA斜面上，37 ℃恒温培养24 h，置于4 ℃冰箱保存备用。所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。
菌株分离培养基（NA）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。
硝酸盐还原产气培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，KNO3 1.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。
种子培养基：葡萄糖10.0 g，CaCl2 0.2 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，KCl 0.2 g，乙酸钠 3.32 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。
反硝化基础培养基：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，葡萄糖 10.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。
1.2 反硝化性能测定
250 mL三角瓶中加入100 mL反硝化性能测定培养液，灭菌后加入1 mL培养至对数期的菌液，置于120 r/min、30 ℃下培养，每3 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度和细菌生长量（以吸光度OD600 nm表示）。
1.3 菌株的鉴定
菌落形态及生理生化鉴定：30 ℃培养24 h，观察菌落形态；革兰氏染色、碳源利用等生理生化指标测定参照文献[10]的方法进行。
16S rDNA PCR扩增和序列测定：将菌株保存至平板中，送往上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序和分析。
1.4 菌株生长条件及脱氮特性
1.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源，贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变，灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液，然后置于120 r/min、30 ℃条件下培养，分别在0、12、24、36、48 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度，计算其去除率。
1.4.2 最适温度 以葡萄糖为碳源，配制化学需氧量（COD）为200 mg/L、NO3--N质量浓度为10 mg/L的贫营养反硝化性能测定培养基，灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液，分别置于15、20、25、30、35、40 ℃下，120 r/min连续振荡培养24 h，测定培养液中的NO3--N浓度，计算其去除率。
1.4.3 最适初始pH 培养温度30 ℃，初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他试验设计同“1.4.2”。
2 结果与分析
2.1 样品的富集培养及菌种的分离纯化
污泥样经过3次富集培养后得到混合微生物的培养物，它可以在含有200 mg/L NO3--N的合成培养基（FM）中生长，在培养过程中通过测定培养液的OD600 nm和NO3--N的浓度，发现该混合培养液中的NO3--N含量不断减少，而OD600 nm不断上升，说明该混合液培养物具有很强的好氧反硝化能力。
上述混合培養物在对氯苯胺的BTB平板上进行划线分离，挑取单菌落，经过复筛、纯化后得到1株具有高效脱氮功能的耐盐好氧反硝化细菌菌株MCW148。
2.2 MCW148菌株反硝化性能
通过实验室模拟养殖系统废水的水质（表1）分析，把MCW148菌株接种于NO3--N初始浓度为150 mg/L的合成培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养，定时取样测定菌体生长、NO3--N和NO2--N的浓度情况。结果（图1）表明，MCW148能在12 h内将NO3--N浓度从140 mg/L以上降至0.05 mg/L以下，同时，NO2--N的浓度先逐步升高，然后逐步降低至0.05 mg/L以下，说明MCW148菌株具有高效的反硝化脱氮能力。另外，由图1还可知，MCW148菌株的生长同步于NO3--N浓度的降低，且MCW148菌株的生长曲线、NO3--N的代谢曲线中的迟缓期基本都在0～3 h，然后进入对数期（4～15 h），约在24 h达到最高的菌体生长量。
2.3 菌株的鉴定
菌株MCW148在LB培养基平板上培养2 d的菌落为乳白色，圆形，中间凸出，表面光滑湿润，直径在1 mm左右；细胞呈直杆状，1.0 μm×3.0 μm，革兰氏阳性，常以成对或链状排列，单极毛（图2）。接触氧化酶阳性；可利用葡萄糖、柠檬酸钠、阿拉伯糖、木糖等为碳源，但利用葡萄糖效果最好；硝酸盐还原和反硝化阳性。扩增菌株MCW148的16S rRNA部分基因，长度为1 516 bp。序列分析表明该菌株与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的同源性最高，为99%[4，11]。结合菌株的形态和生理生化特征，将菌株MCW148初步鉴定为巨大芽孢杆菌。目前，国内外在好氧反硝化菌领域进行了大量的研究[12-16]，但在芽孢杆菌属中，具有耐盐和好氧反硝化能力的细菌却鲜有报道。
2.4 MCW148菌株生长条件及脱氮特性
2.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源，贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变，接种MCW148菌株，在30 ℃、120 r/min摇床条件下培养2 d，定时取样测定NO3--N浓度。图3的结果表明，菌株MCW148能够利用多种碳源进行脱硝酸盐氮，其中，碳源为葡萄糖时，NO3--N的去除效果最佳，培养12 h去除率便达到了62.4%；其次是柠檬酸钠，NO3--N在培养12 h时去除率为34.2%，24 h去除率达到了59.7%；丁二酸钠、草酸钠24 h的NO3--N去除率分别为45.8%和33.7%；而菌株MCW148基本不利用乙酸钠为碳源。因此，葡萄糖为菌株MCW148的最适碳源。
2.4.2 最适温度 由图4可知，MCW148菌体生长和反硝化的温度适宜范围为30～40 ℃，在35 ℃时NO3--N去除率最高，为74%。另外，由图4可以看出，MCW148的生长和反硝化存在一个临界温度，即25 ℃，一旦低于这个温度，MCW148的生长和代谢活性显著降低，因此，该菌嗜高温而对低温非常敏感，建议35 ℃为其最适生长温度。
2.4.3 最适初始pH 由图5可知，MCW148菌株在pH 5～9的范围内对NO3--N的代谢去除活性均较高，其最佳pH为6，此时的NO3--N去除率为60%。
3 小结
本研究从渤海某海水养殖场（北美白对虾）底泥中分离到1株耐盐高效好氧反硝化细菌，经过对其形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株在去除NO3--N的同时，也能降解COD。菌株MCW148在不同种类碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次为葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠、草酸钠、乙酸钠。其生长和代谢NO3--N的最佳条件是温度35 ℃、pH 6，在此条件下，盐度为3%时，菌株MCW148能达到最佳生长状况和最大去除率，12 h对NO3--N的去除率为62.4%。
菌株MCW148具有生长速度较快、对NO3--N去除率高的特点，今后，将对该菌株的代谢机理、酶的影响等方面做进一步的探讨和研究，并结合其他脱氮微生物以及固定化技术，可为海水水产养殖水质改良等方面提供技术支持。
参考文献：
[1] 任华峰，姜天翔，邱金泉，等.复合微生物菌剂在海水养殖废水净化中的试验研究[J]. 环境污染与防治，2015（7）：111.
[2] ROBERTON L A，KUENEN J G. Aerobic denitrification： A controversy revived[J]. Archives of Microbiology，1984，139（5）： 351-354.
[3] 李彦芹，李春青，管鹏悦，等.一株好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮条件研究[J].环境科学与技术，2015，38（7）：33-37.
[4] 郑喜春，郭晓军，姚 娜，等.反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定及反硝化特性[J].生态学杂志，2012，31（6）：1447-1452.
[5] 张 凯，雷梦婕，胡国元，等.好氧反硝化细菌WIT-1的分离鉴定及其脱氨氮特性[J].武汉工程大学学报，2011，33（11）：14-18.
[6] 马 放，张 佳，张献旭，等.生物陶粒反应器中好氧反硝化细菌的脱氮研究[J].中国环境科学，2007，27（4）：529-533.
[7] 吴智导，黄少斌，卢 乐.曝气生物滤池处理含硝态氮废水的研究[J].水处理技术，2012，38（1）：80-83.
[8] 于爱茸，李 尤，愈吉安.一株耐氧反硝化细菌的筛选及脱氮特性研究[J].微生物学杂志，2005，25（3）：77-81.
[9] 杜立刚，张聪琳，陈宝玉.生物反硝化生物脱氮技术研究进展[J]. 能源与环境，2015（4）：66-68.
[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[11] KIM J K，PARK K J，CHO K S. Aerobic nitrification denitrification by heterotrophic Bacillus strains[J]. Bioresource Technology，2005，96：1897-1906.
[12] 丁 炜，朱 亮，徐 京，等.好氧反硝化菌及其在生物處理与修复中的应用研究进展[J].应用与环境微生物学报，2011，17（6）：923-929.
[13] 王弘宇，马 放，苏俊峰，等.不同碳源和碳氮比对一株好氧反硝化细菌脱氮性能的影响[J].环境科学学报，2007，27（6）：968-972.
[14] 王弘宇，马 放，苏俊峰，等.含硝氮废水的好氧反硝化处理及其系统微生物群落动态分析[J].环境科学，2007，28（12）：2856-2860.
[15] 乔 南，陈瑞佳，于大禹.硅藻土负载异氧硝化-好氧反硝化菌的脱氮性能[J].化工进展，2015，34（5）：1459-1465.
[16] 车 鉴，徐 牧，阳桂菊，等.硅藻土固定化颗粒污泥对海水养殖废水除氨性能[J].环境工程学报，2014，8（12）：5318-5322.
推荐访问： 硝化 鉴定 特性 分离 脱氮
