摘要：QWH132、QZL1-2、QWH 7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101是笔者所在实验室从辽宁千山地区自行分离的含有cry8类基因的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），具有鞘翅目杀虫活性。本研究在6株菌株中成功发现并克隆了6个靶标生物为鞘翅目的cry8类基因，其中被鉴定为cry8C类、cry8D类、cry8F类（大小为3 525 bp）、cry8K类的基因各有1个，被鉴定为cry8E类的基因有2个，其大小分别为3 534、3 495 bp。后4个基因已在GenBank注册，登记号依次为KC778983、KC778983、KC778984、KC778985。将6个基因插入pEB表达载体，经过PCR检测与 SDS-PAGE 分析证实它们能在大肠杆菌中进行异源表达，这6个基因的表达约有126～128 ku的蛋白，这些菌株中的Cry8蛋白为进一步发掘我国天然的苏云金芽孢杆菌资源与构建新的杀鞘翅目昆虫的高效工程菌提供了重要的试验材料与新思路。
关键词：苏云金芽孢杆菌；大肠杆菌；质粒；cry8基因；克隆；表达；生物信息学分析
中图分类号：Q785文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）10-0028-04
收稿日期：2014-01-07
基金项目：国家“863”计划（编号：2011AA10A203、2010RCB54）。
作者简介：孙钰航（1984—），男，黑龙江牡丹人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：weiweiabcd222@163.com。
通信作者：高继国，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前应用最多也是应用最广泛的生物杀虫剂。它是天然的昆虫病原菌，对无脊椎动物中的4个门（包括节肢动物门中的16个目的3 000种以上）的害虫有活性[1]，而对非目标生物安全，从而广泛用于防治鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等农林害虫[2]。苏云金芽孢杆菌能够产生多种杀虫活性物质，其中主要有Cry蛋白、Vip蛋白、Sip蛋白，其中对Cry蛋白与Vip蛋白的研究较深入[3]。随着研究与应用的深入，Bt杀虫基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物广泛应用的过程中已发现多种昆虫在实验室条件下对Bt毒素产生抗性，在田间也发现了具有抗性的个体[4]，因此，筛选、克隆新的高毒力、杀虫谱广且不易产生抗性与交互抗性的基因是解决问题的重要途径之一[5]。Cry8类蛋白质在Bt中分布比较广泛，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀灭作用[6]。但目前成功防治鞘翅目害虫的Bt菌株和产品数量还相对较少，鞘翅目害虫是粮食作物、经济作物、园艺和森林的重要害虫，因此分离新的对鞘翅目害虫具有较高杀灭效果的Bt菌株并研究其杀虫蛋白基因，对于开发高效安全的生物杀虫剂和生产转基因作物有重要的理论和实践意义[7]。近些年发现的Bt杀虫活性物质另外一种Sip蛋白也具有鞘翅目害虫活性，Sip蛋白的发现为Bt杀虫活性蛋白提供了一条新思路[8]。笔者所在实验室自行分离出QWH132、QZL1-2、QWH7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101菌株，经鉴定这些菌株中含有cry8类具有鞘翅目杀虫活性的基因。本研究以这些菌株为模板，分离克隆菌株中的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因，并对其中所含的cry8类基因进行克隆与表达。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源本试验所用菌株分离自辽宁千山采集的土样，采用醋酸钠-抗生素筛选法进行分离[9]。其余菌株质粒见表1。
1.1.2酶及生化试剂2×Taq mix、2 × Primer Star mix均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；其他均为市售国产或进口分析纯或电泳级纯化学试剂。
1.1.3主要仪器主要仪器包括Labnet PCR仪[Multigene Gradient（TC9600-G-230V）]、蛋白电泳仪（BIO-RAD MiNi-PROTEAN Tetra system）、离心机Beckman（AllegraTM64R Centrifuge）、北京赛智创业科技有限公司生产的ChampGel 6000全自动凝胶成像系统Gel Documentation And Image Analysis System等。
1.1.4培养基与抗生素液体LB：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，加水定容到1 000 mL，调pH 值为70；固体LB：在液体培养基中加入1.3%琼脂。1/2固体LB：蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1 000 mL，加入1.3%琼脂，调pH值至7.0；将氨苄青霉素、卡那霉素配制成100 mg/mL的水溶液，经0.22 μm过滤器过滤除菌，-20 ℃ 保存。
1.2方法
1.2.1从土壤中分离Bt菌Bt菌株分离纯化的方法参照文献[10]。表1菌株与质粒
菌株质粒特点描述来源大肠杆菌
（Escherichia coli）Rosetta
F-ompT hsdSB （RB-mB-） gal dcm λ（DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]） pLysSRARE（CamR）笔者所在实验室
JM109
rpsL（strr）、thr、leu、thi-1、lacY、galK、galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、Δ（lac-proAB）、[F′，traD36，proAB，laclqZΔM15]笔者所在实验室苏云金芽孢杆菌QWH132笔者所在实验室QZL1-2笔者所在实验室QWH 7-2笔者所在实验室QZL144-1笔者所在实验室QZL144-2笔者所在实验室QWH101笔者所在实验室PlasmidspMD19-T VectorAmprTaKaRa公司pEB
lac 操纵子、T7 启动子、多克隆位点、HisoTag、HSVoTag、lacZ 起始密码子、大肠杆菌启动子，Ampr笔者所在实验室
pEB8C-likepEB载体和cry8C-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8D-likepEB载体和cry8D-like基因重组质粒，Ampr笔者所在实验室pEB8E-likepEB载体和cry8E-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8F-likepEB载体和cry8F-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8K-likepEB载体和cry8K-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室
1.2.2Bt总DNA的提取将菌株在固体LB培养基上培养12 h左右，再放入到1.5 mL EP管中，加入TE、2%十二烷基硫酸钠（SDS）各 200 μL，充分混匀；加入200 μL Tris饱和酚与200 μL 三氯甲烷，混匀，12 000 r/min离心10 min；取上清，加入1.5倍上清体积的异丙醇，50 μL的5 mol/L NaCl溶液，轻微振荡混匀；12 000 r/min离心10 min，弃上清，并加入200 μL 无水乙醇，沉淀DNA；离心，弃上清，干燥沉淀，用适量的ddH2O溶解。
1.2.3cry基因的扩增和克隆参照GenBank中公布的cry8类基因序列设计引物（表2），以提取的Bt基因组为模板，利用高保真DNA聚合酶和DNA聚合酶分别进行PCR扩增，方法参照文献[11]。
表2各的引物序列情况
引物名称序列（5′→3′）cry8-like F1ATGAATTCAAATAATCAAAATGAATcry8-like R1AATGGAGTTACGAACCTGAATcry8-like F2CCAAATGAAAAACGGTTGTTATGGGATGCcry8-like R2TGAGTCGTTTTGCCTCTTTCACTGCcry8-like R3TTACTCTACGTCAACAATCAATT
1.2.4基因测序基因测序由博仕生物医学服务中心完成，DNA序列分析采用DNAMAN、NCBI-BLAST软件进行。
1.2.5基因在大肠杆菌中的表达用KOD酶对cry8类基因进行克隆，胶回收产物连接pEB表达载体、转化到大肠杆菌JM109中[12]进行PCR鉴定，筛选出阳性转化子转化到大肠杆菌Rossetta中进行IPTG诱导表达，具体方法参照文献[13]。收集诱导物，离心，弃上清，用10 mmol/L Tris-HCl（pH值为8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样，进行 SDS-PAGE 分析[14]。大肠杆菌质粒DNA 提取、酶切、连接、转化及Bt质粒提取参照文献[15-16]中的方法，杀虫晶体蛋白样品制备和SDS-PAGE 电泳检测方法参照文献[17]。
2结果与分析
2.1菌株分离
将分离得到的菌株接种于LB 固体培养基上，30 ℃培养48 h，涂片、烘干、固定、镜检，通过光学显微镜与电镜观察（图1）可知，菌体均为长杆状，芽胞为长圆棒状，晶体为球形。
2.2cry8类基因全长的克隆
采用TaKaRa公司生产的聚合酶与其设计的通用引物对菌株DNA模板进行PCR扩增，回收PCR产物，通过测序确定其基因类型分别为1个cry8C基因片段、1个cry8D基因片段、2个cry8E基因片段、1个cry8F基因片段、1个cry8K基因片段，参照GenBank中公布的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因序列设计全长引物，利用TaKaRa公司生产的聚合酶进行PCR扩增，得到3 548、3 435、3 534、3 495、3 525、3 522 bp 的6个片段。扩增产物进行胶回收后和pMD19-T载体连接，获得了重组质粒，这些质粒被命名为pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like。转入大肠杆菌JM109中，通过蓝白斑筛选阳性克隆子，并对其测序。
2.3菌株中cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因的序列分析
对pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like进行序列测定，得到6个核苷酸序列，其编码区长度分别为3 548、3 435、3 534、3 495、3 525、3 522 bp，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。
pMD8C-like DNA序列碱基分布为A：988、C：733、G：599、T：1 228，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ca1相似度最高，最大同源性为100%。pMD8D-like DNA序列碱基分布为A：1 179、C：576、G：706、T：974，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Da1相似度最高，最大同源性为100%。pMD8E-like1 DNA序列碱基分布为A：1 229、C：584、G：766、T：955，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ea1相似度最高，最大同源性为98%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778984。pMD8E-like2 DNA序列碱基分布为A：1 215、C：576、G：761、T：943，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ea1相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778985。pMD8F-like DNA序列碱基分布为A：1 253、C：572、G：728、T：972，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Fa1相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778983。pMD8K-like DNA序列碱基分布为A：1 244、C：581、G：732、T：965，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ka2相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778982。
2.4菌株氨基酸的序列分析
对pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like进行氨基酸序列分析，其中Cry8Ca1与pMD8C-like蛋白序列无差别，全长共1 160个氨基酸，分子量为126.3 ku；Cry8Da1与pMD8D-like蛋白序列无差别，全长共1 144个氨基酸，分子量为125.8 ku；Cry8Ea1 DNA与pMD8E-like1 蛋白序列对比发现，起始端中多出一段MVDLQAAANSLVI氨基酸残基序列，全长共1 177个氨基酸，分子量为128.0 ku；Cry8Ea1 DNA与pMD8E-like2 蛋白序列对比后发现，第341位F被C替换，第492位F被L替换，第818位K被N替换，第872位D被G替换，第946位Q被R替换，全长共1 164个氨基酸，分子量为126.5 ku；Cry8Fa1 DNA与pMD8F-like 蛋白序列对比发现，第1 042位L被K替换，第1 126位S被T替换，全长共1 174个氨基酸，分子量为127.6 ku。Cry8Ka2 DNA与pMD8F-like 蛋白序列对比后发现，第9位E被G替换，第891位V被I替换，第1 144位P被Q替换，全长共1 173个氨基酸，分子量为 127.6 ku（图3）。
2.5Cry8C、Cry8D、Cry8E、Cry8F、Cry8K蛋白在大肠杆菌中的表达
将全长PCR片段回收后，与表达载体pEB连接，转入大肠杆菌Rosetta中进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明基因能在Bt中表达，其表达蛋白为126～128 ku。
3结论与讨论
Bt杀虫晶体蛋白广泛应用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目以及线虫、螨类和原生动物等多种重要的农林害虫的防治[18]。但是，目前能够用于转基因植物的Bt基因种类单一，我国具有自主知识产权的新型基因较少，用于转基因抗虫作物开发的基因十分有限[19]。地下害虫是国内外公认的难防治的土栖性害虫，已成为制约我国农业、林业、畜牧业的重要因素之一，Bt菌由于具有毒力高、专一性强、对非靶标生物无害等特点，成为防治地下害虫的重要途径。
Cry8类蛋白质在Bt中分布较广泛，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有抑杀作用[14]。对蛴螬有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry23、cry18、cry37、cry43等基因[14]。其中，研究最多的是cry8类基因，cry8类基因由 1 160～1 210个氨基酸组成，分子量在128～137 ku之间。笔者所在实验室筛选到了7株cry8类基因，但这7株菌株中除了含有已经鉴定的基因外，还可能含有一些其他的cry8类杀虫基因，需要新的方法去发掘。
本研究对笔者所在实验室采集并保存的包括辽宁千山地区分离得到的120株Bt菌株进行Bt cry基因的鉴定，共检出7株包含cry8类基因菌株，其中cry8C类2株、cry8E类3株、
cry8F类1株、cry8K类1株，其中2株菌基因型完全相同，由于分离时间差异可排除同菌株污染。cry8类基因检出率为9.2%，本试验中所用的土样采取于东北地区不同地域，该地域纬度偏高、年均温度较低，可能导致出菌率较低。
辽宁千山地区植被丰富、昆虫种群丰富且土壤含腐殖质丰富，能从这些土壤中分离出多个含有cry8类基因的菌株，证明该菌株在自然环境中存在较为普遍，充分证明我国地域辽阔、生境类型多样、生物多样性丰富，是生物物种的天然基因库[20]。
本研究从菌株QZL144-2所得到的cry8Ea基因与已知基因5个位点存在差异，与已知菌株对比，其上氨基酸序列第341位F被C替换，第492位F被L替换，第818位K被N替换，第872位D被G替换，第946位Q被R替换；从菌株QWH101中得到的cry8Ka基因与已知基因3个位点存在差异，其上氨基酸序列第9位E被G替换，第891位V被I替换， 第 1 144 位P被Q替换，有研究表明Cry毒力蛋白中只要有几个氨基酸位点发生变化，就会引起毒力和杀虫谱的显著变化[16]，所以对其后续的活性研究依旧具有重要意义。
将菌株QZL144-1序列得到的cry8Ea基因与已知的cry8Ea对比发现，其起始氨基酸序列中多出一段MVDLQAAANSLVI氨基酸残基，这个发现与已知的模式基因cry7A、cry7B的起始序列差别很像，可能会有比较大的活性差异[16]。本研究从1株菌株中成功克隆了含有2个8类基因cry8Ca、cry8Ea的菌株，虽然其同源性为100%，但研究价值较高，证明cry8基因在对蛴螬有活性的Bt菌株中经常是共存的[15]。本试验分离出来的cry8类菌株均完成了大肠杆菌Rosetta（DE3）的异源表达，表达蛋白均为128 ku左右。由于试验条件所限，进行鞘翅目生物活性测定的结果并不理想，蛋白的试验组杀虫活性与对照组差异不显著，可能是由于实验室环境下鞘翅目幼虫生存环境产生较大差异，从而导致幼虫死亡。
本试验分离出多个cry8类基因，其中不同种类的cry8类基因是否有协同作用有待后续研究，尤其是对同一菌株含有2个以上Cry8类蛋白是否会有增效作用需要着重研究。由于试验菌株来自天然的Bt菌株，其中天然存在的cry8基因并且成功地进行异源表达可以为构建高效杀地下害虫活性重组微生物提供重要的基因来源，丰富了抗虫基因库且对于其后续的杀虫活性与交互抗性研究提供了很好的试验素材与理论价值。
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