摘要：ATP荧光快速检测微生物的方法有传统平皿法不可比拟的优势，即使该方法目前没有取代平皿法成为细菌检测的国家标准方法。从ATP 生物发光法原理、荧光试剂活力和检测仪器类型3个方面详尽分析了该方法的优势和局限性，并总结了ATP荧光法在不同行业的实际应用情况，为该方法在国内的普及应用提供参考。
关键词：ATP荧光法;ATP生物发光法原理;荧光试剂活力;检测仪器;微生物检测;国标法
中图分类号：TS207.4 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.08.021
Abstract：ATP fluorescence method for rapid detection of microorganisms has incomparable advantages over the traditional plate method，even though this method has not replaced the plate method as the national standard method. In this paper， the advantages and limitations of the ATP bioluminescence method were analyzed in detail from three aspects，namely，the mechanism of ATP bioluminescence method，the activity of fluorescent reagent and the type of detection instruments，and the practical application of ATP bioluminescence method in different industries was summarized in order to provide some references for the popularization and application of this method in China.
Key words：ATP fluorescence;ATP biluminescence method mechanism;fluorescent activity;instruments;microbial detection;national standard method
ATP荧光快速检测细菌总数的方法近些年被广泛应用在各个行业。国内有些乳品厂的品控部门已经将该法作为奶站原料奶收集的判断标准;应用该方法的物表检测试剂也在各个卫生监督部门广泛使用，大大提高了餐饮等卫生行业监督的效率[1-3]。但该方法目前仍没有取代平皿法写入国家标准方法中，而且也没有统一的行业标准，只有个别企业内部根据实际情况或部分市县局卫生监督部门根据各自地区的卫生情况自行设定的检测标准[4]。
目前，一些省市级卫生监督部门已经采购了荧光试剂和配套的荧光检测仪。在日常工作中相关卫生部门通常会采用该方法在大型群體活动中使用，比如在省市的运动会中对餐饮具的卫生实时监控，不仅保障了食品卫生的安全，而且一旦出现细菌总数超标的情况，可以第一时间排查细菌的污染源头。但因没有国家标准，很难根据检查的结果进行相应的判罚，所以卫生监管部门一般只在应急活动中使用。而荧光法在欧美等国家的应用较国内则更为普遍，因该方法可以实时快速地提供半定量的结果，使许多食品企业将此方法作为企业内部的质控标准，大大提高了工作效率，保障了产品的卫生质量。不仅如此，因价格相对便宜、操作简单，普通百姓也将此方法应用在日常生活中。
1 荧光法反应原理的优势和局限
1.1 ATP荧光法较平皿法有不可比拟的优势
首先，该方法的原理是利用去污剂裂解细菌的细胞壁，从而释放细菌中的ATP，通过萤火虫荧光素酶催化反应将化学能转化成光能，光能又会通过光路放大转化成电信号，通过仪器直接读出检测结 果[5]。从ATP的释放到酶促反应的完成，最终由仪器显示检测的结果，整个过程不超过5min。平皿法采样前期不仅准备工作繁琐，而且细菌培养耗时、平皿生长菌落数难以把控，以上问题通过ATP荧光法都可以很好解决。所以，ATP荧光法的操作流程和工作效率等方面相对平皿法都有较大优势和更广阔的应用前景。
1.2 ATP生物检测所面临的问题
ATP荧光法属于生物检测试剂，优点是反应快速，但几乎所有生化反应均需要解决的就是生物试剂的活力问题。该方法反应的基础是酶促反应，而反应中的核心物质——萤火虫荧光素酶的活力对整个检测结果起到至关重要的作用。该酶对热温度敏感，温度超过25 ℃会对酶的活力造成不可逆转的损伤[6]。一旦反应中酶的活力降低，将直接导致检测结果比实际值偏低，如高温时间过长甚至导致酶活力全部丧失，检测结果为零。目前，市场上销售和使用的检测试剂因夏季炎热大都需要携带冰盒和冰袋进行低温保存，携带不便，如遇环境高温过久，冰袋融化较快，即使携带保温设备，实际检测中仍会造成检测结果偏低。如果通过冷冻干燥的方法将试剂制成干粉状来提高试剂的稳定性，将大大提高该方法的应用范围[7]。
1.3 ATP荧光法仍然没有取代平皿法成为检测细菌总数的国家标准方法
ATP荧光法应用甚广为何迟迟没有取代或是补充到国家标准检测方法中，主要是此法的检测结果缺少统一的标准，而标准结果的制定又与试剂和仪器2个方面有关。
首先，因为此法的基本原理是酶促反应，单位时间内，相同底物浓度的反应速度与酶（萤火虫荧光素酶）的浓度及活性相关，酶的浓度及活性越高，反应速度越快，而在相同的检测时间内，酶活及酶含量高的试剂检测到的光产物则越高[8]。目前，市场上有多家公司在销售不同品牌的ATP荧光检测试剂，但行业内和国家并没有规定试剂中酶的浓度和比活力，所以有时会造成试剂灵敏度不同，检测结果偏差很大。
其次，该方法的直接产物是光，将光信号转化成电信号则需要特殊的光学部件来完成。不同的仪器对光子转化的原理有很大的不同，灵敏度最高的是以光电倍增管为核心原件的一类仪器，该类仪器灵敏度高，但体积稍大、不方便携带，且仪器成本 高[9];另一类是以光电池为原件的仪器，灵敏度较光电倍增管低几个数量级，但体积小、成本低，便于携带及普及应用[10]。同样，目前并没有相关部门明文规定要使用哪一类型的仪器作为标准仪器。基于对检测结果影响最为关键的试剂和仪器2个因素均存在不确定性，短时间内很难制定出国家统一的标准。因此只有在试剂的灵敏度、仪器的型号、检测的方法和流程细化后，才能使该方法成为细菌检测的国家标准方法提供可能性。
2 目前ATP荧光法市场应用及存在的问题
2.1 牛奶检测
ATP荧光法应用最多的当属乳品行业，因为该方法的优势在乳品行业得到了充分的体现。首先，牛奶属于营养富集品，细菌在牛奶中的生长为20 min一代，用国标平皿法需48 h才可以得出检测结果，检测之前没有菌落超标的样品已经超标，之前细菌超标的已经变质。所以平皿法对牛奶中细菌检测是完全滞后的。因平皿法检测流程繁琐，乳品企业在收集不同奶站的牛奶时，无法实时检测，往往因个别牛奶细菌总数超标造成整罐牛奶变质而造成巨大损失。如果冒然将未知检测结果的牛奶提前进行销售，一旦质量出现问题，对人体健康和品牌效应的影响则更无法估量。因此ATP荧光法的实时检测可以很好地弥补平皿法的缺陷。其次，牛奶中细菌总数较多，国标法要求牛奶中每毫升细菌总数不得超过2×106 CFU/g（mL），对检测结果的灵敏度和精确度要求不高，虽然ATP荧光法不能与平皿法检测的结果一一对应，但2种方法有一定的相关性，相关系数可达0.98，所以ATP荧光法在乳品行业的应用更有价值[11]。
鲜牛奶中含有一定量游离的ATP，会对检测结果造成影响，而且牛奶体细胞中同样含有大量的ATP，当使用细菌裂解液裂解细菌细胞壁时，体细胞也会被裂解开，释放出的ATP同样对检测结果有影响。目前的方法是通过一次性无菌的滤膜，孔径为0.45 μm，可以截留98%的细菌和体细胞，通过PBS缓冲液冲洗掉游离的ATP，再通过体细胞裂解液裂解体细胞并释放ATP，同样通过缓冲液去掉体细胞释放的ATP。通过上述方法排除游离的ATP和体细胞中ATP的干扰。最后，通过细菌裂解液释放滤膜截留细菌的ATP并检测相对发光值（RLU）。但该方法也有其自身的局限性，因牛奶为高蛋白的营养物质，放置过久牛奶中的蛋白质会聚集沉淀出来，加压过滤去掉游离和体细胞中的ATP时，沉淀的蛋白质会导致滤膜的堵塞，从而无法排除体细胞中ATP的干扰，导致检测结果不准确。而且乳品企业每日检测的样品较多，如果全部检测成本过高也是现实中存在的问题。
2.2 物体表面清洁度的检测
ATP荧光法在物体表面洁净度检测方面的使用最为广泛，物表检测因其采样的方法[12]、物体表面的粗糙及处理情况不同等原因，检测的结果与平皿法的结果相关性没有与牛奶检测结果的相关性好。但作為半定量的一种监控方式则非常实用，比如对卫生要求比较严格的环境，如医院、食品生产车间等，近些年已经有大量的医护工作者应用该方法对医院的托盘、护士双手、电梯、卫生间等各个方面进行分析[13-15]。还有对手术器械等严格消毒的样品进行分析，但此时对试剂的灵敏度及抗干扰能力则要求更高。该方法也经常被用在餐饮部门的餐饮具洁净度检测中，有些清洁过的餐饮具如长时间放置也会滋生细菌，如果卫生部门通过实时的方法当场检查，当场给出检测结果，并进行相应的惩处，则对餐饮行业的威慑力非常大，对餐饮商家的自律起到不可估量的影响。因为物表细菌检测的特殊性，ATP荧光法很难与国标平皿法进行定量比较，但可以根据大量检测数据给出半定量的检测限，通过检测结果并结合各行业自身的卫生要求自行设定合格、警告、不合格等检测标准[4]。
2.3 饮用水的检测
ATP荧光法检测水中细菌总数的结果与国标平皿法结果的相关性相对于牛奶和物表的更高，但实际应用却较少。因为日常生活饮用水都进行过消毒，细菌较少，加之水中营养缺少，细菌不易滋生，正常城市生活饮用水细菌超标的情况较少，细菌超标多是发生在直接饮用地下水的偏僻地区或被工厂废水污染的周边地区。此时应用该方法可以第一时间排查污染源头，防止事态进一步扩大[16-17]。目前检测水应用较多的是游泳池、自来水厂、啤酒厂等[18]。
2.4 科研领域
ATP荧光法也被应用在科研领域中，ATP是所有生物的能量物质，也是能量转换的基本单位，检测能量物质ATP的增加和减少则可以反映生命活动进行的程度[19]。体内能量物质的代谢大都由酶来催化完成，而以核酸为底物的聚合酶促反应则由ATP水解提供能量，测定反应前后ATP含量的变化可以间接反映酶促反应进行的程度。因为减少了细菌裂解等前处理步骤，ATP作为底物直接参加酶促反应，所以检测的结果更为准确，有多种根据此原理开发的ATP检测试剂盒被应用在科研领域中。在农业方面，杨国栋，刘杰等人[20-21]也通过该方法检测土壤中微生物的含量来监测土壤质量等相关指标。
2.5 特异菌的检测
ATP荧光法检测细菌总数的理论基础之一就是不同的细菌中所含的ATP含量大致相等。通过ATP含量测定推测出细菌的总体数量。但有些方面需要检测特异菌的存在或数量。目前，市场上绝大多数的试剂都是检测细菌总数，但如果想让该方法应用更为广泛，特异菌的检测必不可少[22]。目前已经有检测特异细菌的荧光试剂上市，一般是通过免疫法富集目的特异细菌，再通过冲洗非特异细菌来排除其他细菌干扰[23]。但日常检测要求致病微生物不得检出，此时对该方法的灵敏度则是非常大的挑战。目前的荧光试剂检测个位数的特异菌仍有很大困难。
3 结语
ATP荧光法在欧美国家已经被发现、采用、应用了许多年，2010年之前市场上销售的绝大多数为进口试剂，价格昂贵，在企业内部难以普及使用，近些年，国产的荧光试剂和配套的检测仪器大量涌现，但基于试剂、仪器和细化的操作流程等诸多因素，导致仍没有形成国家级的检测标准，使该方法不能通过行政手段快速普及和使用。虽然国产的荧光试剂相比进口试剂便宜许多，但单次的检测成本仍是平皿法的10倍以上，价格也是导致该方法普及使用推进缓慢的因素之一。其次，许多样品都需要特殊的前处理，比如化妆品中细菌数量极少，膏状物又不能通过浓缩进行细菌富集，仍需要3～5 h在37 ℃进行扩增培养[24-25];干粉中的细菌多为孢子，目前的裂解液很难将其彻底裂解，导致ATP释放不完全，同样需要将样品进行前处理[26-28];检测肉制品的细菌总数时，剪碎或研磨的样品无法通过半透膜去除游离的ATP等[29]。
首先，如果可以降低该方法的检测成本，并将不同类别样品的前处理的细节做得更好，即使没有国家级的标准出台，该方法作为企业内部产品质控标准也不失为一种理想的方法;其次，如何加深产品实时监控的理念也尤为重要，目前许多企业通过HACCP很好地控制了产品的生产过程，ATP荧光法就是很多相关企业实施过程监控的有效手段之一;最后，相关部门也应完善产品召回的制度，加大不合格产品的惩罚措施，防止有些企业存在侥幸心理，放松产品生产过程监控。
参考文献：
Becker B，Fechler J，Holzapfel W H. Hygiene and cleaning control in the food chain with the ATP bioluminescence method[J]. Fleischwirtschaft，2004（1）：121-124.
Aycicek H，Oguz U，Karci K. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the de-termination surface cleanliness at a hospital kitchen[J]. Int J Hyg Envir Heal，2006（2）：203-206.
Chen F C，Godwin S L. Comparison of a rapid ATP biolumines-cence assay and standard plate count methods for assessing microbial contamination of consumers" refrigerators[J]. Journal of Food Protection，2006，69（10）：2 534-2 538.
曹利蓉，张伟. ATP生物发光法在铁路站车食品器具卫生学检验中的应用[J]. 铁道劳动安全卫生与环保，2004，31（2）：86-87.
李桂明，宋敏训，赵增成，等. 细菌 ATP荧光检测与常规计数相关性研究[J]. 山东农业科 学，2015，47（2）：111-113，118.
徐澍，邹秉杰，王建平，等. 耐热荧光素酶的表达及热稳定焦磷酸测序体系的建立[J]. 生物工程学报，2012，28（6）：763-771.
陈艺，陶治玮，陈文清，等. β-葡萄糖苷酶冻干保护剂的研究[J]. 中国酿造，2016，35（9）：109-112.
Mcelroy W D. Crystalline firefly luciferase：LH2+ATP LH2-AMP+PPLH2-AMP+O2：L-AMP+light+H2O[J]. Methods in Enzymology，1963（6）：445-448.
倪树标，何丽媛，陈云，等. ATP熒光快速检测仪的研制[J]. 广东化工，2017，44（16）：206-209.
董曼曼，卫星华，孙晓，等. 手持式 ATP荧光检测仪性能评价[J]. 食品安全质量检测学报，2018（11）：2 627-2 630.
李春艳，霍贵成，王德国，等. ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究[J]. 食品工业科技，2008，29（7）：233-238.
张伟，田野，孙巍，等. 应用ATP生物荧光法进行表面微生物污染监测的可行性研究[J]. 江苏预防医学，2017，28（1）：15-21.
文翠容，戚扬，李庆虹，等. 医务人员手卫生和院内感染情况调查[J]. 白求恩军医学院学报，2009，7（1）：8-9.
杨晓君. 医务人员手卫生依从性调查[J]. 中华医院感染学杂志，2011，21（9）：1 847-1 848.
石劭红，陈昌辉，卢爽. 口腔科患者医院感染现状调查分析[J]. 中华医院感染学杂志，2014，24（3）：711-712.
张寒，周珉，张利华，等. ATP技术用于工业水厂微生物监测的研究[J]. 环境科学导刊，2015，34（5）：107-111.
余辉. 新型水环境微生物检测方法研究[D]. 天津：南开大学，2012：30-36.
伍季，王燕，章建军，等. ATP生物发光法快速检测啤酒中的菌落总数[J]. 河南科学，2006，24（1）：63-65.
Lohmann K. Uber die pyrophosphatfraktion immuskel[J].Naturwissenschaften，1929（17）：624-625.
杨国栋，马玉新，杨素萍，等. 荧光素酶法测定活性污泥中的ATP[J]. 分析测试技术与仪器，1998，4（4）：241-244.
刘杰，屠腾，纪玉蕊. 松花江流域沉积物 ATP 微生物量的分布特征[J]. 中国环境科学，2015，35（1）：171-178.
李海月，黄继红，张新武. ATP 生物发光法快速检测食源性致病菌的研究[J]. 河南工业大学学报（自然科学版），2016，37（1）：67-71.
Stender H，Sage A，Oliveira K，et al. Combination of ATP-bioluminescence and PNA probes allows rapid total counts and identifi-cation of specific microorganisms in mixed populations[J]. Journal of Microbiological Methods，2001（2）：69-75.
张浩. ATP 生物荧光法快速检测化妆品中菌落总数的研究[J]. 工业微生物，2017，47（5）：53-56.
Tanaka H，Shinji T，Sawada K，et al. Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria[J]. Wat Res，1997，31（8）：1 913-1 918.
冯敏，高岳. ATP发光技术测定辐照前脱水蔬菜和调味品的含菌量[J]. 核农学报，2005，19（4）：282-285.
Chen F，Kazarians G A，Venkateswaran K，et al. A rapid microdetection system for the enumeration of bacterial endospores[J]. IEEE，2006（11）：9-12.
Sakakibara T，Murakam S，Kazuhiro I. Enumeration of bacterial cell numbers by amplified firefly bioluminescence without cultivation[J]. Analytical Biochemistry，2003（12）：48-56.
舒柏華，孙丹陵，王胜利，等. 肉类食品细菌污染生物发光快速分析技术研究[J]. 中国公共卫生，2003，19（4）：483-484.
推荐访问： 局限性 领域 卫生 荧光法 ATP
