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1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g，（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003，实验动物从业人员上岗证号：赣3936）。
1.1.2 药物 TP（批号：160513，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司）。
1.1.3 试剂与仪器 弗氏完全佐剂7001（北京博蕾德生物科技有限公司，生产批号：160308）;牛II型胶原蛋白20022（北京博蕾德生物科技有限公司，生产批号：160177）;酶标仪（Multlskan Mk3赛默飞世尔仪器有限公司）;计算机（TFT185W80PS冠捷显示科技有限公司）;大鼠TNF-α试剂盒（KIT，XL-Er0201 Abcam公司）;转轮式切片机（徕卡-2016，德国）;TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机（常州市中威电子仪器有限公司）;BMJ-Ⅲ型包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）;PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）;数码三目摄像显微镜（BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司）等;图像分析软件Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机选取8只作为空白对照组，其余进行造模。将牛Ⅱ型胶原蛋白与弗氏完全佐剂在冰浴条件1∶ 1乳化，形成稳定的乳化剂（水中成团）。在大鼠尾根部2 cm处注射乳化劑0.2 mL/只，7 d后在离大鼠尾根部1.5 cm处注射乳化剂0.1 mL/只再次免疫1次。
从初次免疫第1天起，每日观察四肢肿胀情况，按照0～4级评分标准进行评分[5]，0分：无关节炎;1分：小趾关节轻度肿胀;2分：小趾关节和足跖肿胀;3分：踝关节以下的足爪肿胀;4分：包括踝关节在内全部关节肿胀。四肢评分之和为关节炎指数（Arthritis Index，AI），AI越高，表明关节炎程度越严重。初次免疫后第14天进行关节炎指数评分，AI≥4即为造模成功，将AI评分不足大鼠剔除，最终随机选取56只CIA模型大鼠进行实验。将56只CIA模型大鼠，按评分梯度均匀分为模型组、基质组、TP灌胃组、TP微乳高剂量组、TP-MBGs高、中、低剂量组，每组8只。
1.2.2 给药方法 空白对照组和模型组正常饲养，TP灌胃组灌胃给药，其余各组均涂在患病关节部位，给药量见表1，1次/d，连续给药28 d，为方便给药各组大鼠给药部位定期进行剃毛处理。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 大鼠皮肤组织CD1α、IgA平均吸光度的测定 取大鼠皮肤，4%多聚甲醛固定后均按病理检验SOP程序进行。脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后镜检。采用BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取1个区域400倍采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的吸光度（absorbance A），并计算其平均值。
1.2.3.2 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α、ColⅡ、IL-10的水平 各组大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉，于腹主动脉取血，室温放置1 h，取上清液2 000 r/min离心10 min得血清。采用ELISA法检测血清中ColⅡ、IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α的含量，其操作过程按照试剂盒提供的方法进行。
1.2.3.3 采用ELISA法测定大鼠滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α水平 在无菌条件下，取各组大鼠膝关节滑膜组织，用D-hank′s液洗涤3次以去除血细胞，仔细剔除脂肪组织后，获得较纯的白色滑膜组织块。剪成约1～2 mm2大小，Ⅱ型胶原酶消化3 h后，离心收集未贴壁的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化5 min，离心弃去上清液，将细胞重悬于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，置37 ℃ 5% CO2条件下培养48 h，离心收集上清液，-80 ℃冰箱保存备用。按照试剂盒说明测定滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α的含量。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TP对大鼠皮肤组织CD1α、IgA平均吸光度的影响 模型组与空白对照组比较，CD1α表达水平明显升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;其余各给药组与模型组比较，CD1α均有降低趋势，其中TP灌胃组和TP-MBGs高剂量组降低程度明显（P<0.05），基质组与模型组几乎相等，而IgA的表达在各组之间差异无统计学意义。见表2。
2.2 TP对大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α、ColⅡ、IL-10水平的影响 模型组与空白组比较，大鼠血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α水平均升高，差异有统计学意义（P<0.01），而ColⅡ与IL-10无统计学意义;基质组与模型组比较，各因子水平几乎相等;其余各组与模型组比较，TP灌胃组、TP微乳高剂量组及TP-MBGs高剂量组中IFN-γ浓度显著性降低（P<0.05），TP-MBGs中、高剂量组及TP灌胃组的TNF-α水平显著降低（P<0.05），TP灌胃组及TP-MBGs中剂量组的IL-6的水平显著降低（P<0.05）;ColⅡ和IL-10的水平无明显变化，差异无统计学意义。见表3。
2.3 TP对大鼠滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-α的影响 模型组与空白组大鼠比，滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2及TNF-α的含量均有升高，差异有统计学意义（P<0.01）;基质组与模型组比较，IL-1、PGE2、TNF-α水平几乎相等，差异无统计学意义;而与模型组比较，TP灌胃组、TP-MBGs高、中剂量组及TP微乳高剂量组中IL-1、PGE2及TNF-α的含量均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
3 讨论
CIA模型在临床表现、病理组织学及体液免疫反应方面与RA有诸多相似之处，是目前复制RA最佳的动物模型[6-7]，故本实验选择CIA為RA的动物模型进行研究。树突状细胞（DC）是目前所知功能最强的抗原提呈细胞，它的数量和活性将会直接影响免疫应答过程，从而直接参与RA的发展过程。CD1α是树突状细胞的特征性抗原，在皮肤中大量表达并发挥免疫作用[8]。本实验结果表明，模型组与空白比较，CD1α的表达水平显著升高，而TP灌胃组，TP-MBGs高剂量组与模型组比较，CD1α的表达水平显著降低（P<0.01），说明在制备大鼠类风湿关节炎模型后，免疫功能出现异常，树突状细胞表达水平升高，RA的发展与树突状细胞的表达密切相关，而TP-MBGs外用可通过下调皮肤中CD1α的表达水平从而起到治疗RA的作用。
RA是自身免疫性疾病，因此对血液和关节滑膜细胞中的细胞因子进行研究，其中IL-6是一种重要的多效性细胞因子，由体内多种细胞分泌，是RA的关键细胞因子。它对RA的主要致病作用包括促进炎性反应相关的B细胞和Th17细胞的分化以及急性期蛋白的合成;诱导破骨细胞分化，造成关节损伤;与IL-1共同诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，破坏关节软骨等[9]。在RA患者血清及受累关节的滑液中均可观察到IL-6浓度升高，并且浓度升高与患者临床表现的轻重相关[10]。TNF-α是一种多效性的细胞因子，是RA发病过程中主要的促炎因子，被认为是与RA滑膜炎性反应的发生和发展关系最密切的促炎递质，在RA的局部滑膜炎性反应、血管翳的生成和组织损伤中都发挥了重要作用，可作为疾病活动度的重要指标。本实验中，空白组与模型组比较，大鼠血清中IL-6、TNF-α及IFN-γ的水平显著升高，表明RA的发病过程与炎性反应因子的水平密切相关。TP灌胃组与TP-MBGs中剂量组相较于模型组，IL-6水平显著降低;TP灌胃组、微乳高剂量组及TP-MBGs高剂量组的IFN-γ浓度较模型组显著降低;与模型组比较，TP灌胃组及TP-MBGs中剂量组的TNF-α的表达水平显著降低。表明TP-MBGs外用可通过降低血清中相关炎性反应因子，发挥全身作用，从而达到治疗RA的效果。
在机体处于炎性反应情况下，IL-1被大量表达，它的2种亚型IL-1α和IL-1β在介导炎性反应和免疫过程中发挥重要作用。适量的IL-1可以增强机体抵御外界入侵的能力，而过多IL-1则引起关节损害，表现出类似RA的症状。在RA发病中IL-1可以刺激成纤维细胞增殖和血管翳生成，诱导产生更多PGE2，引起白细胞向滑膜部位聚集以及金属基质蛋白酶、胶原酶的分泌，加剧关节破坏[11]。本实验中，较空白组，模型组大鼠滑膜细胞上清液中的IL-1、PGE2及TNF-α的水平明显升高;较模型组，TP灌胃组、微乳高剂量组、TP-MBGs中、高剂量组的IL-1及TNF-α水平显著降低;TP灌胃组、TP-MBGs中剂量组及TP-MBGs高剂量组中PGE2浓度明显降低。基质组与模型组差异无统计学意义，说明基质对RA不产生影响，表明TP-MBGs可降低局部滑膜细胞中的致炎因子，且TP-MBGs与灌胃组效果相当，这可能是其外用治疗RA的作用机制之一。
综上所述，TP-MBGs外用治疗RA，可能通过调节皮肤免疫功能及抑制相关细胞因子的分泌，从而起到局部及全身治疗作用。TP-MBGs外用与TP口服相比效果相当，均有一定的治疗效果。其中微乳凝胶基质对RA无明显的治疗效果TP-MBGs较TP微乳指标更趋向于空白对照组，治疗效果更好。
参考文献
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（2019-06-05收稿 责任编辑：徐颖）
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