摘要 将小球藻和盐藻在含终浓度为0.5 μmol/L的石油培养液中连续培养21 d，利用血球计数法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法和蒽酮比色法，分别测定其生长曲线、叶绿素a含量、胞内外蛋白和胞内外多糖含量。结果显示：2种微藻的细胞密度均在培养第21天达最大值，小球藻生长受到抑制，盐藻与对照组无明显差别；小球藻叶绿素a含量为对照组的48%，而盐藻叶绿素a含量却明显增加，培养第21天是对照组的2.5倍；2种微藻的胞内外蛋白含量均高于对照组，均在培养第10天达最大值，随后逐渐降低，但降低幅度和速度均低于对照组；2种微藻的胞内外多糖含量均低于对照组。研究表明，在含低浓度石油的海水培养液中，小球藻和盐藻都具较好的耐受性，且盐藻比小球藻具有更强的生长能力，更适合在含低浓度石油的海水中大规模培养，具有更高的开发价值。该研究为利用石油污染海水大规模培养微藻的藻种开发奠定了理论基础。
关键词 小球藻；盐藻；石油污染；微藻培养；生化分析
中图分类号 TQ514 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）04-0226-03
近年来，由于化石能源资源逐渐枯竭，原油价格几度上涨，世界各国都考虑用其他资源来代替石油，生物柴油作为一种可再生能源越来越受到重视[1]。我国能源专家认为：可大量生产的可再生能源——生物柴油（biodiesel），对增加中国石油安全系数具有非常重要的战略意义[2]。某些微藻（microalgae）因含有较高的油脂、易于大规模培养、单位面积产量比大豆等作物高等因素，被视为最新的甚至是唯一能实现可以替代石化柴油的生物柴油原料。微藻又称单细胞藻类，是指只有在显微镜下才能观察和辨别其形态的微小藻类。和高等植物相比，它们利用太阳能有更高的效率，将水和CO2等无机物质转化合成为有机物质[3]。在20世纪80年代，美国等发达国家率先开展了微藻燃料研究，筛选了3 000余种微藻，从这3 000多种微藻中选取了300多种用于提取可燃性油脂，结果发现绿藻门中的海洋微藻油脂含量比其他门中的微藻高，具有开发的价值[4]。海水小球藻（Chlorella sp.）和盐生杜氏藻（Dunaliella salina）都属于海洋经济微藻，绿藻门，生长周期短，培养简单，油脂含量高[5-6]。对于利用微藻处理废水的研究国内外已经有了很多报道[7-9]，利用市政污水培养有前途的小球藻燃料已在国外有所研究[10]，但利用石油污染海水对海洋微藻进行培养的研究却罕见报道，若能将海洋石油污染的生物修复与微藻燃料开发利用相结合，这将对海洋环境改善和人类发展具有重要意义。该研究利用含石油的海水培养液培养小球藻和盐藻，着重对它们的生化成分进行分析，为利用石油污染海水培养微藻及其开发利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
海水小球藻（Chlorella sp.）C-02和盐生杜氏藻（Dunaliella salina）Ds-04为实验室筛选并保存的石油耐受性较强的藻种。海水采自大连金石滩海域，经0.45 μm滤膜过滤，高压灭菌后使用。培养液F/2成分见文献[11]。
1.2 试验仪器与药品
试验用主要仪器为SPX-250B-G微电脑光照培养箱（上海托莫斯科学仪器有限公司）、UV-7504单光束紫外-可见光分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），药品和试剂均为国产分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1 微藻培养。将微藻接种于盛有500 mL F/2培养液的1 L三角瓶中，培养3 d后，往培养液中添加终浓度为0.5 μmol/L的标准石油（标准石油的制备参见文献[12]）。接种密度分别为小球藻细胞0.56×106～0.59×106个/mL，细胞盐藻0.43×106～0.46×106个/mL，生长速率计算公式参照文献[13]。在光照培养箱中培养，温度（22±1）℃，冷白光，光强3 000 lx，光周期12/12（光照/黑暗），在每天上午和下午人工摇动2次，每次相反方向各1.5 min。添加标准石油后连续培养21 d，分别在第10、15、21天测量微藻的各种生化成分，不添加石油组设为对照，每组设3个平行样。
1.3.2 藻体计数。运用分光光度法，分别在640、560 nm波长下测量小球藻和盐藻的OD值，在光学显微镜下采用0.1 mL血球计数板进行细胞计数，得到OD值与细胞密度之间的关系方程为：小球藻y=0.026 8x+0.031 0，R2=0.997 3；盐藻y=0.147 5x-0.074 5，R2=0.990 1，其中y为细胞密度（×106个/mL），x为OD值。每天计数1次，连续计数21 d。
1.3.3 细胞内、外蛋白质浓度的测定。蛋白质采用考马氏亮蓝染色法测定[14-15]，以牛血清清蛋白作标准物。
1.3.4 细胞内、外总糖浓度的测定。总糖采用蒽酮比色法测定[15-17]，以葡萄糖作为标准物。
1.3.5 叶绿素a含量测定。吸取藻液5 mL，5 000 r/min转速下离心10 min，加入95%乙醇5 mL，避光摇晃1 min，然后放入4 ℃冰箱黑暗静置24 h，5 000 r/min转速下离心10 min，吸取上清液分别在665、649 nm波长下测量吸光度，根据公式计算叶绿素a含量：叶绿素a（mg/L）=13.96×OD665-6.89×OD649。
2 结果与分析
2.1 在含石油的培养液中小球藻和盐藻的生长状况
从图1可以看出，第1～15天小球藻的细胞密度与对照组无明显差别，第16～21天小球藻的细胞密度明显低于对照组，在第21天达最大值40.49×106～42.34×106个/mL，低于对照组23.2%。从图2可以看出，盐藻的细胞密度在培养第21天达最大值48.06×106～49.56×106个/mL，与对照组无明显差别。这反映出在含石油的培养液中盐藻适应性更强，比小球藻具有更强的生长能力，也表明较低浓度的石油成分对盐藻生长几乎没有影响或影响不大，但对于小球藻的影响比较明显，且抑制了小球藻的生长。
2.2 含石油培养液中的小球藻和盐藻的蛋白含量分析
从图3、4可以看出，利用含石油的培养液培养的小球藻和盐藻均在培养第10天胞内蛋白含量达最高，分别为1.59、1.11 mg/mL，分别比对照组增加31.5%、33.3%。随着培养时间延长，两者胞内蛋白含量均降低。其中，盐藻降低幅度较小，而小球藻降低幅度达50%以上（p<0.01）。与胞内蛋白相似，利用含石油的培养液培养的小球藻和盐藻胞外蛋白含量均在培养第10天达最大，分别为1.09、1.05 mg/mL，其中，小球藻是对照组的1.7倍（p<0.01），随着培养时间的延长，两者胞外蛋白含量也均降低，但降低幅度和速率明显低于对照组（图5、6）。这表明小球藻和盐藻在含低浓度石油的培养液中有良好的耐受性。
2.3 含石油培养液中小球藻和盐藻的多糖含量分析
从图7、8、9、10可以看出，在含石油的培养液中培养的小球藻和盐藻的多糖（胞内和胞外）含量均低于对照组，表明培养液中添加的石油成分不利于微藻多糖的积累。
2.4 含石油培养液中小球藻和盐藻的叶绿素含量分析
从图11可以看出，培养前15 d小球藻叶绿素a的含量与对照组相差不大，但培养第21天，小球藻的叶绿素a含量仅为对照组的48%。从图12可以看出，盐藻的叶绿素a含量与对照组相比明显增加（p<0.01），且随时间延长增加幅度逐渐增大，培养第21天达最大值0.51 mg/L，是对照组的2.5倍。这表明在含低浓度石油的培养液中盐藻比小球藻有更强的光合作用能力。
3 结论与讨论
（1）从生长曲线可以看出，在含石油的培养液中盐藻比小球藻生长能力更强，与对照组相比细胞密度并无明显差别，而小球藻的生长受到了抑制。
（2）对在含石油的培养液中培养的小球藻和盐藻的生化成分分析，结果表明：①小球藻和盐藻的胞内外蛋白质含量均高于对照组，均在培养第10天达最大值，随后都逐渐降低，盐藻的降低幅度和速度更小，对低浓度石油的适应性更强；②培养液中添加的石油成分抑制微藻多糖的积累；③小球藻叶绿素积累受到抑制，但盐藻的叶绿素含量明显增加，盐藻光合能力更强。
（3）盐藻与小球藻相比，是更适合利用石油污染的海水进行大规模培养的藻种，更具潜在开发价值。
4 参考文献
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