摘 要：采用响应面法优化腈水合酶产生紫红红球菌的发酵培养基。以天冬酰胺、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、酵母抽提物、脲素、氯化钴为影响因子，以菌体干质量和酶活为响应值，进行多元二次响应回归分析，结果显示，最优培养基为：天冬酰胺含量0.04%、磷酸氢二钾0.05%、磷酸二氢钾0.03%、酵母抽提物（FM818）5.48%、脲素0.55%、氯化钴0.01%；在摇瓶中进行验证试验，优化条件下菌体干质量为33.98 mg·mL-1、酶活为167.57 U·mL-1；对照条件下菌体干质量26.6 mg·mL-1、酶活为125.63 U·mL-1，此优化培养基使干质量、酶活分别提高了27.74%和33.38%。
关键词：响应面分析；紫红红球菌；腈水合酶；丙烯酰胺
中图分类号：TQ225.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.005
Optimization of the Fermentation Medium of Rhodococcus rhodochrous Using Response Surface Methodology
LI Xiao1,2,3, ZHANG Ya2 , LI Jian-hua2, YAO Juan1, LI Pei1, LIANG Yun-xiang3, LI Zhi-hong1, YU Xue-feng1
(1.Angel Yeast Company Limited,Yichang,Hubei 443003,China; 2.College of Chemistry and Biology, Three Gorges Univerity,Yichang,Hubei 443002,China; 3.College of Life Science, Huazhong Agricultural University,Wuhan, Hubei 430068,China)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: This research, response surface methodology(RSM) was utilized to optimize the fermentation medium of Rhodococcus rhodochrous which can produce nitrile hydratase. Asparagines,dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, yeast extract, urea, and cobalt chloride were selected as influencing factors . Dry cell weight(DCW) and enzyme activity was used as the response values and RSM was applied to analysis the results. The optimum fermentation medium obtained by RSM analysis were as follows,0.04% asparagine, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.03% potassium dihydrogen phosphate, 5.48% yeast extract, 0.55% urea and 0.01% cobalt chloride. Finally, Verification test was accomplished in shaking flasks, DCW and enzyme activity were 33.98 mg·mL-1 and 167.57 U·mL-1 respectively, compared to that of the control (DCW and enzyme activity were 26.6 mg·mL-1 and 125.63 U·mL-1 respectively), DCW and enzyme activity were increased by 27.74% and 33.38%, respectively.
Key words: response surface methodology; Rhodococcus rhodochrous; nitrile hydratase; acrylamide
丙烯酰胺(简称AM，结构式为CH=CH—CONH2)是一种用途广泛的重要有机化工原料，可用于合成聚丙烯酰胺，市场需求很大[1-2]。以前常用化学合成法合成丙烯酰胺，现在，用生物合成法合成丙烯酰胺已成为热门研究课题之一[3-4]。生物合成原理主要是利用腈水合酶在温和条件下将丙烯腈转化成丙烯酰胺，目前已知能产生腈水合酶的微生物有：红球菌 (Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、节杆菌(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、诺卡氏菌 (Nocardia)等[5]。所有腈水合酶均为胞内酶，微生物体内产腈水合酶量的大小取决于培养环境条件、培养基营养成分及酶表达所需诱导剂等[6]。
响应面法（RSM）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法[7-9]。本研究采用响应面法优化腈水合酶产生菌紫红红球菌的培养基，得到了较好的结果。
1 材料和方法
1.1 菌 种
紫红红球菌Rhodococcus rhodochrous CGMCC 4.1147T。
1.2 培养基
种子培养基：葡萄糖 1%，天冬酰胺 0.05%，K2HPO4 0.05%，安琪酵母浸出物FM818 0.2%，牛肉膏0.2% MgSO4·7H2O 0.05%，pH值7.2。
发酵培养基：葡萄糖2.31%，天冬酰胺0.05%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%，安琪酵母浸出物FM818 2%，牛肉膏0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，脲素0.1%，氯化钴0.1%，pH值7.2%。
单因子培养基：在其他成分不变的情况下改变单个因子的浓度；响应面培养基：葡萄糖 2.31%， 牛肉膏 0.2%，其他组分按表1、表2添加。
1.3 菌体培养
种子培养：将斜面种子接种于摇瓶种子培养基中，摇床转速为150 r·min-1，在28 ℃条件下培养24 h。
发酵培养：将种子以10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于 150 r·min-1，28 ℃振荡培养72 h。
1.4 测定方法
干质量（dry cell weight，DCW）的测定[10]：菌体浓度定义为单位体积菌液中所含菌体经烘干至恒质量时的质量，单位为g·L-1。计算公式：菌体浓度Cx（mg·mL-1）=菌体细胞干质量/发酵液体积
酶活的测定溴化法[11-12]：腈水合酶活力的定义：28 ℃时每分钟生成1μmol丙烯酰胺为1U。
相对酶活的定义：每mL发酵液中所具有的腈水合酶的酶活，单位为U·mL-1发酵液。
还原糖含量的测定DNS方法[10]。
NH4+的测定苯酚-次氯酸盐法[10]。
氨基氮的测定甲醛氧化法[10]。
2 结果与讨论
2.1 单因素影响试验
研究发现，天冬酰胺、酵母浸出物（YE）、Co2+、脲素均对菌体生长及腈水合酶有一定影响。当天冬酰胺浓度达到0.05%时，菌体的菌浓（DCW）和酶活均达到最大值，当其浓度进一步增加时，DCW和酶活下降。随着YE浓度的增加，DCW和酶活均增加，考虑到YE的溶解度，选择5%含量作为下一步培养基优化条件。当氯化钴浓度达到0.05%时，酶活达到最大，当其浓度进一步增加时，酶活下降，但菌体的DCW基本没变化，这可能是腈水合酶是金属酶，在酶的活性中心含有螯合的金属离子，Co2+作为辅助因子，Co2+只参与酶的折叠，故对DCW的贡献不大，但Co2+浓度过低，没有完全发挥对酶的诱导作用，酶活较低，Co2+浓度过高会对菌体产酶有抑制作用。选择氯化钴含量为0.05%作为下一步的培养基优化条件。当脲素浓度达到0.07%时，DCW和酶活达到最大，当脲素浓度再增加时，酶活下降，选择脲素含量为0.07%作为下一步的培养基优化条件。
2.2 响应面设计试验
2.2.1 响应面设计方案及结果 在单因子的基础上，用中心组合设计进行六因素三水平的试验设计，选择对紫红红球菌影响较大的几个因素：天冬酰胺、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、酵母抽提物、脲素、氯化钴，分别以A、B、C、D、E、F代表，每个自变量按低、中、高3个水平分别进行编码，以干质量和酶活为响应值。设计的因素及其水平如表1所示。
2.2.2 模型的建立与显著性检验 从表2各组试验干质量和酶活的数据中可大致看出，当菌体干质量较大时酶活也较高，表明菌浓与酶活有一定的相关性。
分别以DCW及酶活为响应值，应用Design Expext 软件，对表2的干质量、酶活结果进行分析，结果如表3、表4所示，数据经过二次回归拟合后，可得干质量的回归方程（1），酶活的回归方程（2）。
Y1=14.02+0.44A-0.69B+0.26C+13.40D+1.69E-9.38F+0.25AB-0.19AC+0.11AD-0.13AE-0.48AF-0.042BC-0.85BD+0.41BE+0.23BF+0.15CD+0.60CE-0.25CF+0.82DE-2.73DF-0.63EF-1.15A2-0.032B2-3.30C2+6.05D2-0.70E2+5.82 F2 （1）
Y2=68.42+2.05A-3.18B+1.61C+64.05D+10.15E-48.30F+1.38AB-1.25AC+0.74AD-0.42AE-3.22AF-1.36BC-3.22BD+2.20BE+0.57BF+1.27CD+4.71CE-0.41CF+3.76DE-7.05DF-3.45EF-4.22A2+1.90B2-24.41C2+30.21D2-2.23 E2+34.79F2 (2 )
由表3、表4可知：干质量模型、酶活模型回归显著（模型回归P＜0.000 1），失拟不显著；该干质量模型的回归系数R2=0.968 3，Raj2=0.932 6，酶活模型的回归系数R2=0.945 7，Raj2=0.884 9，表明模型拟合度很好，预测值和实测值的相关性好，可以用来预测紫红红球菌发酵时的生长产酶情况。
在干质量模型中D（酵母抽提物），E（脲素），F（氯化钴）, DF, C2, D2, F2 的P值均小于0.01，表明酵母抽提物、脲素、氯化钴对紫红红球菌的生长是高度显著的，而且酵母抽提物、氯化钴对紫红红球菌干质量的贡献不是简单性的变多。而在D（酵母抽提物）, E（脲素）, F（氯化钴）, DF, C2, F2 的P值均小于0.05，证明脲素、氯化钴的作用是显著的；其中D的P值小于0.000 1，表明酵母抽提物对酶活的影响是高度显著的，而且酵母抽提物、氯化钴对紫红红球菌干质量的影响也是明显的；进一步吻合了对表2各组试验干质量和酶活的数据的分析，菌体浓度和酶活成一定的正相关性，因此，在紫红红球菌的发酵过程中，提高菌体浓度尤为重要。
2.2.3 响应面分析图 响应面的三维（3D）立体图如图1所示，响应面最高点表示DCW或酶活的最大预测值，由Asn与KH2PO4及Asn与尿素的交互作用可看出，Asn、KH2PO4和尿素趋近于某一浓度时，DCW或酶活有最大预测值，即DCW或酶活的模型方程有最优解。说明该模型设计合理。
2.2.4 验证性试验 根据求得的最优回归方程和试验结果，得到最优的培养基组合：天冬酰胺含量0.04%、磷酸氢二钾0.05%、磷酸二氢钾0.03%、酵母抽提物5.48%、脲素0.55%、氯化钴0.01%，菌体干质量DCW可达34.014 1 mg·mL-1，酶活可达168.768 U·mL-1。为了验证优化的可靠性，在摇瓶中进行了对照组、优化组的验证试验，结果如表5所示。
3 结 论
本研究通过单因子试验确定了紫红红球菌发酵的主要影响因子及最佳浓度，进一步通过响应面设计、Design Expext软件分析，得到优化培养基，其组分为：天冬酰胺0.04%、磷酸氢二钾0.05%、磷酸二氢钾0.03%、酵母抽提物5.48%、脲素0.55%、氯化钴0.01%，通过对二次回归方程求最大值预测菌体干质量可达34.014 1 mg·mL-1，酶活可达168.768 U·mL-1。
在摇瓶中进行验证试验，得到优化条件下菌体干质量为33.98 mg·mL-1、酶活为167.57 U·mL-1，与软件预测基本吻合；较优化前的培养基，干质量、酶活分别提高了27.74%和33.38%，对紫红红球菌的培养及腈水合酶的生产有一定的指导作用。
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收稿日期：2011-06-24;修订日期：2011-08-10
作者简介：李啸(1969-)，男，湖北人，副教授，博士，主要从事微生物反应过程的优化与控制方面的研究。
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