摘要：介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法，对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选研究进行了综述，同时就宏基因组技术在未培养微生物研究中的应用进行了展望。
关键词：宏基因组；新型酶；未培养微生物
中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）18－3673-04
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ in Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｎｅｗ Ｅｎｚｙｍｅｓ from Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ＪＩＡＮＧ Ｈａｉ－ｑｉｎ１，ＦＡＮ Ｃａｉ－ｙｕｎ２，ＬＩ Ｌü－ｍｕ１，ＣＨＥＮＧ Ｊｉａｎ－ｂｏ１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ２３００３６， Ｃｈｉｎａ；
２．Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ were described， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ，ｓｏｉｌ ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ； ｅｎｚｙｍｅ； ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
自然界中大多数微生物不能通过传统的分离培养技术获得其纯培养，从而导致环境微生物中的多样性基因资源难以被发现［１］。近年发展起来的宏基因组学技术，是继纯培养技术、现代分子生物学技术之后的一门新技术，它是通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组ＤＮＡ，并克隆到适宜的微生物宿主中，然后筛选出目的克隆与基因的方法。构建宏基因文库是开发未培养微生物基因资源的一条有效途径。
１宏基因组技术研究方法
１．１样品总ＤＮＡ的提取
样品总ＤＮＡ的提取方法有：直接提取法［２］与间接提取法［３］。直接提取法是将样品直接悬浮于裂解缓冲液中，然后再提取。此方法简便，成本较低，但由于机械损伤较大，因而所获得的片段较小。间接提取法是采用较温和的方法，将分离出来的菌体用低熔点琼脂糖等包埋来进行ＤＮＡ的提取。该方法可以获得片段较大的ＤＮＡ，但是成本高，可能会在微生物分离时有丢失的现象。
１．２宏基因组文库的构建
构建文库的关键在于选择适宜的载体和宿主。根据所需构建的文库基因片段大小，载体大致分为３种：①适用于克隆片段小于１０ ｋｂ及单基因的克隆和表达，如ｐＵＣ１９。②适用于插入片段在４０ ｋｂ左右，如ｃｏｓｍｉｄ、ｆｏｓｍｉｄ。可以获得多基因簇调控的微生物活性物质的代谢途径。③适用于外源片段为５０～３００ ｋｂ，如ＢＡＣ。该载体携带大量外源基因，可以发现更多的功能基因及更复杂的代谢途径。依据转化效率、重组载体在宿主中宏基因的表达等因素来选择适宜的宿主。目前已经构建的宏基因文库所用的广泛性宿主均为Ｅ． ｃｏｌｉ，另外假单胞菌、链霉菌也可以作为宿主。
１．３宏基因组文库的筛选
基于序列的筛选：用已知功能基因的保守序列来设计杂交探针或ＰＣＲ引物，再通过杂交或 ＰＣＲ扩增筛选宏基因组文库，获得目标片段序列。其优点是适用于具有保守序列的功能基因的筛选、鉴定分类学标记的序列分析［４］。其缺点是必须对相关功能基因序列有一定的了解并且目标基因有一定的保守区域，所以较难发现新型的活性基因， 也很难获得其全序列，筛选出来的基因相似性比较高。
基于功能的筛选：功能驱动的宏基因组文库的筛选是依据文库中的一些阳性克隆能表达的性状这一特性来进行筛选，利用其在特定筛选培养基上的表观特性进行筛选［３］。先获得具有生物活性的阳性克隆，再进行亚克隆鉴定，然后通过对插入序列片段的测序和生物学分析，从而获知相应的基因信息。其优点是可用于检测酶的新基因或获取新的生物活性物质。其缺点是阳性克隆的筛选主要依赖于功能基因在宿主菌中的表达，而很多异源基因在特定宿主中表达效率不是很高，从而会导致筛选工作的失败。
２宏基因组技术与新型酶筛选
２．１瘤胃微生物宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选
目前，国内外已构建牛、羊等反刍动物瘤胃微生物宏基因组文库，已筛选出多种酶基因（表１）。
２．２土壤宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选
土壤中含有丰富的微生物资源，宏基因组技术将会推动人们对土壤微生物的代谢、多样性的研究。到目前为止，土壤宏基因组技术在新型酶筛选方面已得到广泛运用（表２）。
２．３其他环境宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选
除上述环境外，还有许多环境都包含着许多不被人所知的微生物，如极端环境、海绵、表面水、人的唾液等；宏基因组技术能帮助人们有效地认识微生物，同时获得更多的新型酶，将其广泛应用到工业生产中（表３）。
３展望
宏基因组学技术利用免培养方法，改变了以往微生物纯培养技术的弊端，为全面调查和挖掘未培养微生物的多样性及开发利用其资源提供了一种有效手段。利用宏基因组技术筛选新型酶基因被证实是一种行之有效的方法，在新型的工业用酶及生物活性物质的筛选等方面，效率远远超过其他方法，并且具有广阔的前景，是基因工程研究的一个主要方向［４５］。宏基因组技术使分子生物产业投入到工业应用中，为工业的发展提供了一个前所未有的机遇［４６］。但是该技术在筛选新型酶的应用中还存在不足之处。比如总ＤＮＡ提取中会有部分片段丢失；筛选的技术需要改进：对于序列分析法来说，测序的速度和费用的问题对该技术的影响还比较大。功能分析法需要高通量的筛选方法，其中最重要的是提高异源基因的表达和从巨大的文库中有效地筛选目标克隆；筛选酶时依赖于宿主表达，有些酶也许为胞内酶，无法释放到胞外，有些酶分泌过多会导致细胞死亡。因此，需要不断探索和改进。
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