摘要：小花棘豆是棘豆属植物中危害较严重的毒草，其植株体内含有毒素物质-苦马豆素，国内外对含苦马豆素小花棘豆植株的研究发现，植物毒性与其内生真菌有关。本文综述了小花棘豆内生真菌的体外培养及鉴定、内生真菌与苦马豆素之间的关系，以期更好地研究和了解小花棘豆内生真菌。
关键词：小花棘豆；内生真菌；苦马豆素
中图分类号： R284 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-10-26-2
小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）属于豆科（Fam.Leguminosae Juss.）棘豆属（Oxytropis DC.） 多年生的草本植物，是内蒙古分布的棘豆属植物中危害较严重的毒草[1]，它可以引起牲畜慢性中毒，采食小花棘豆的牲畜在初期体重稍有增加，但是在采食量逐渐增多时身体会开始消瘦，继而出现精神沉郁、四肢乏力、反应迟钝、生殖机能受损等中毒症状，严重时可能出现致死的情况。[2]引起牲畜中毒的原因是小花棘豆体内所含的生物碱-苦马豆素 （Swainsonine，SW）所造成，国内外对含苦马豆素植株的研究发现，植物毒性与其内生真菌有关。[3]
1小花棘豆内生真菌的发现
内生真菌是一类生活在植物体内的微生物，它可以生活在健康植物的各组织和器官的细胞内部或细胞间隙，与寄主植物互惠共生。[4]Vogl首次从黑麦草（Lolium temulentum L.）种子当中分离出了植物内生真菌[5]，1993年Strobel从短叶红豆杉内分离出内生真菌—安德氏紫杉霉（Taxomyces andreannae），它能产生新型有肿瘤治疗效果的紫杉醇。[6]2003年Braun等从O.lambertii、O.sericea及A.mollisimus中分离出含苦马豆素的内生真菌Embellisia sp.L12，分析其特征确定此菌株为埃里砖格孢属真菌，它可引起牲畜中毒，且内生真菌中苦马豆素的含量水平与宿主植物苦马豆素含量水平有相关性。[7]2008年卢萍等从分布在内蒙古西部区的6个地理种群小花棘豆中检测出有内生真菌，其微生物学特性与Braun等分离得到的Embellisia sp.L12菌株特征一致。[3]霍红雁等培养出11株小花棘豆内生真菌，通过对其微生物学特性的分析及分子生物学的方法鉴定，推测所分离到的菌株与埃里砖格孢属真菌亲缘关系密切。[8]2011年钱亚光从四个种群的小花棘豆培养出的22株内生真菌同属埃里砖格孢属。[9]
目前研究表明，不同种群小花棘豆植物中分离所获内生真菌主要为埃里砖格孢属真菌。埃里砖格孢属真菌的形态特征与蠕形菌类和暗色丝分砖格孢子类真菌比较相似，但埃里砖格孢属真菌的分生孢子具有明显的横隔膜，依据此特点可进行分类鉴定。[10]
2小花棘豆内生真菌的分离培养及鉴定
传统的真菌分类学研究是通过对菌落形态、菌丝体和分生孢子等微生物学特性的比较从而界定真菌的分类地位。观察小花棘豆内生真菌的上述微生物学特性时，首先将植物组织（主要包括茎和叶的切断）进行表面灭菌，将其用作外植体，选择合适的培养基进行分离培养。
2.1表面灭菌
内生真菌分离过程中，对植物组织进行表面灭菌时可采用乙醇浸泡，次氯酸钠浸泡，无菌水清洗的方法。[3]也有文献报道，可采用乙醇浸泡，升汞浸泡，无菌水清洗的方法[11]，但由于升汞的毒性较大，且因其毒性残留以及对自然环境的破坏作用，目前国内外很少使用此方法，相比较而言次氯酸钠挥发性较好，且毒性较小，因此大都使用使用次氯酸钠浸泡的方法。[12]
2.2体外培养
小花棘豆内生真菌体外培养时最常用的培养基是PDA（马铃薯蔗糖琼脂培养基）[3]。钱亚光2011年对培养出的5株小花棘豆内生真菌进行了固体培养基优化实验，分别选用了PDA培养基、PGA（马铃薯葡糖琼脂培养基）、YBSEA（黄豆芽汁琼脂培养基）和）察氏培养基。发现内生真菌在PDA培养基上生长最快，在YBSEA培养基上生长速度最慢。[9]何珊等对小花棘豆内生真菌固体培养条件进行优化实验，结果表明内生真菌在以葡萄糖为碳源的培养基上生长略快，在以蔗糖和玉米粉为碳源的培养基上生长较慢。[13]
2.3分类地位方面的分子生物学研究
对真菌的分类地位进行研究时，传统的方法是观察菌落形态、菌丝体以及分生孢子等微生物学特征。小花棘豆内生真菌的生活史较复杂且形态特征具有多样性，这样使得依照微生物学特性进行分类鉴定的传统分类方法遇到了困难，分子生物学技术作为新的参考依据，已经成功应用于小花棘豆内生真菌属种的分类地位的研究。[14]核糖体rRNA基因的5.8SrDNA/ITS 广泛应用于真菌分子系统学研究，其中5.8SrDNA区高度保守，主要用于种、属及以上分类层次的系统学研究，ITS（核酸录区间）区中度保守，比较适合于种间及种下关系的研究。[15]Braun等[7]利用核酸录区间（ITS）分别确定了疯草内生真菌属于埃里砖格孢属。卢萍等利用5.8SrDNA/ITS确定了内蒙古分布的6个种群10株小花棘豆内生真菌属于埃里砖格孢属。[3]
3小花棘豆内生真菌与苦马豆素的关系
苦马豆素因最初提取自灰苦马豆（Swainsona canescens）而得名，它是小花棘豆引起牲畜出现中毒症状的重要原因。苦马豆素的分子式为C8H15NO3，属于吲哚兹定生物碱。[16]苦马豆素与甘露糖有高度的亲和性，竞争性抑制甘露糖苷酶的活性，使得甘露糖逐渐积累，细胞内的部分低聚糖因无法正常代谢而聚积，使细胞失去其正常功能，甚至造成细胞死亡，牲畜采食后会出现中毒症状，严重时会致死。[17]另一方面，苦马豆素又可作为一种抗癌药物在医药领域内使用，研究表明苦马豆素可以降低肿瘤细胞在体内的侵袭能力。[18]
苦马豆素进行定性定量检测时可采用薄层色谱（TLC） ，气相色谱法（GC），质谱（MS），以及高效液相色谱（HPLC）等方法。卢萍等用HPLC-MS2 法检测出了苦马豆素含量，发现扩增出内生真菌特异条带的小花棘豆植株同时含有苦马豆素，建立了内生真菌与苦马豆素之间的对应关系。[3]随后从分离培养出的11株小花棘豆内生真菌中提取苦马豆素，用MS和GC对苦马豆素提取液进行鉴定和含量检测，首次发现体外培养的小花棘豆内生真菌能合成苦马豆素，推测植物的苦马豆素毒性应与该内生真菌有关。[19]
4结论与展望
小花棘豆是内蒙古分布的棘豆属植物中危害较严重的毒草，其原因是植株体内所含的苦马豆素。研究内生真菌与苦马豆素之间的相关性可对小花棘豆的治理及开发利用等方面提供基础数据，且对内蒙古草原生态环境的保护、建设以及可持续发展也有积极意义。今后的研究中可扩大小花棘豆的采样地，进行苦马豆素的提取及检测，深入探索内生真菌与苦马豆素之间的相关性，为筛选富含苦马豆素的内生真菌菌株及其在医药领域内的应用奠定基础。
参考文献
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作者简介：霍红雁，女，内蒙古乌兰浩特人，内蒙古民族大学生命科学学院助教，研究方向：植物遗传与分子生物学。
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