摘要：以已分离的１１株纤维素降解菌为材料，采用滤纸崩解法和透明圈法，初步筛选出４株纤维素降解能力较强的菌株。将这４株单菌进行两两组合，研究混合菌系在９ｄ内的ＣＭＣ酶活和ＦＰＡ酶活与单菌发酵之间的异同。结果表明，混合菌发酵ＣＭＣ酶活和ＦＰＡ酶活均优于单一菌株；同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系；并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度、最适初始ｐＨ值、产生还原糖的时间进行了研究，结果表明，在３０℃、ｐＨ值４．５、发酵９６ ｈ时混合菌降解稻草的效果最好。
关键词：纤维素降解菌；筛选；ＣＭＣ酶活；ＦＰＡ酶活；还原糖含量；降解条件
中图分类号：Ｑ９３－３３１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）03－0490-03
Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of
Rice Straw
ＹＡＮＧ Ｙａ－ｚｈｅｎａ，ＭＡ Ｌｉ－ａｎａ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｍｉｎｂ，ＧＡＯ Ｚｈａｎ－ｘｉａｎｇａ，ＤＯＮＧ Ｓｈｅ－ｑｉｎａ
（Ｙａｎgｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ； ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Agronomy， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ of 11 ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｈａｌｏ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅｎ ａ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ as ｔｈｅ ＣＭＣ ａｎｄ ＦＰＡ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ ｔｏ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ ｗａｓ ３０℃， ｐＨ ４．５， ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ９６ ｈ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ＣＭＣ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ＦＰＡ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； dｅｇｒａｄｉｎｇ cｏｎｄｉｔｉｏｎ
纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源。全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为８５０亿ｔ。利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径。纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义，一直是生物技术领域的研究重点［１，２］。在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的，必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成，微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视［３］。而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多，菌种混合发酵的研究较少［４，５］。本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上，着力于筛选降解纤维素的混合菌系，旨在为纤维素的高效转化提供依据。
１材料与方法
１．１菌种
纤维素降解菌分别来自枯树根、烂菜叶、牛粪和牛胃中。
１．２培养基制备
ＰＤＡ培养基：马铃薯２００ ｇ，蔗糖２０ ｇ，琼脂粉２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ值６．５。滤纸条鉴定培养基：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１０％， ＫＨ２ＰＯ４ ０．１０％， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２０％，酵母膏０．０１％，滤纸条（规格为１ ｃｍ×７ ｃｍ）１块，ｐＨ值６．５。纤维素刚果红培养基：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．２０％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１０％，ＮａＣｌ ０．０５％，ＣＭＣ－Ｎａ ２．００％，刚果红０．０２％，琼脂２．００％，ｐＨ值６．５。液体发酵培养基：ＫＨ２ＰＯ４ １．００ ｇ， ＮａＣｌ ０．１０ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３０ ｇ， ＮａＮＯ３ ２．５０ ｇ， ＦｅＣｌ３ ０．０１ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．１０ ｇ，秸秆木质纤维素 ２０．００ ｇ，ｐＨ值７．２０～７．４０。
１．３菌种初筛
透明圈直径（Ｈ）与菌落直径（Ｄ）比值的测定：将１１株保藏菌种（菌种名称分别为Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１１）活化后分别接种到ＰＤＡ培养基上，３０℃培养３ｄ。将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上，３０℃培养４ ｄ后，加入适量1 ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液，浸泡1 ｈ，根据Ｈ与Ｄ比值的大小进行初筛。
单菌株滤纸失重率的测定：将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中，以不接种处理作对照，２８℃摇床培养８ ｄ，分别在２、４、６、８ ｄ时测其失重率。滤纸失重率的测定：用滤纸过滤发酵液，将残留物８０℃烘干称重，用减重法计算出滤纸失重率。失重率＝（培养前底物干重－培养后底物干重）×１００％／培养前底物干重。
将单菌株滤纸失重率较大且Ｈ／Ｄ值大于２．０的菌株作为复筛菌种。
１．４复筛
将初筛所得单菌种进行两两组合，对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。以体积比为１∶１的接种比例、１０％的接种量分别接入固态培养基中。
１．４．１羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备：将发酵液于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心２０ ｍｉｎ，取上清液，备用。②纤维素酶活力的测定方法（ＤＮＳ法）：取Ａ、Ｂ、Ｃ共３支５０ ｍＬ比色管，在Ａ、Ｂ管中分别加入１．５、０．５ ｍＬ的1％ ＣＭＣ－Ｎａ溶液（用ｐＨ值４．８的醋酸－醋酸钠缓冲液配制）适当稀释的酶液， Ｃ管中加入１．５ ｍＬ的ｐＨ值为４．８的醋酸－醋酸钠缓冲液和０．５ ｍＬ酶液，５０℃下保温３０ ｍｉｎ，然后在３支比色管中分别加入２．５ ｍＬ的ＤＮＳ试剂，沸水浴５ ｍｉｎ后放入水中冷却，终止反应，定容至２５ ｍＬ，摇匀，在波长５２０ ｎｍ处测定吸光值（Ｃ管作空白对照），并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量，再折算成酶活力单位。ＣＭＣ酶活力定义为：在ｐＨ值４．８，５０℃条件下，１ ｍＬ酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成１ μｇ葡萄糖的酶量，称为一个酶活力单位，以Ｕ／ｍＬ表示。
１．４．２滤纸酶活（ＦＰＡ）测定取Ａ、Ｂ、Ｃ共３支具塞比色管，在Ａ、Ｂ管中加入ｐＨ值４．８醋酸－醋酸钠缓冲液１．５ ｍＬ和１ ｃｍ×６ ｃｍ规格的新华滤纸条（约５０ ｍｇ），５０℃下预热１０ ｍｉｎ后，加入０．５ ｍＬ适当稀释的酶液，Ｃ管不加底物作空白对照，５０℃下保温６０ ｍｉｎ，然后在３支比色管中分别加入２．５ ｍＬ ＤＮＳ试剂，沸水浴５ ｍｉｎ后立即在水中冷却，终止反应，定容至２５ ｍＬ，摇匀，在波长５２０ ｎｍ处测定吸光值（Ｃ管作空白对照），根据葡萄糖标准曲线计算酶活力。酶活力定义为：在ｐＨ值４．８，５０℃条件下， 1 ｍＬ酶液每分钟水解滤纸条生成１μｇ葡萄糖的酶量，称为一个酶活力单位，以Ｕ／ｍＬ表示。
１．５菌种降解稻草条件研究
还原糖含量测定按照ＤＮＳ比色法［６］进行。
２结果与分析
２．１初筛结果
由经过活化的１１株菌株在刚果红培养基上的生长情况（表１）可知，菌株Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８和Ｎ９的滤纸失重率相对较高；从透明圈与菌落圈直径之比来看，菌株Ｎ１、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８的Ｈ／Ｄ都超过２．０。因此，选取Ｎ１、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８号菌株作为复筛对象。
２．２复筛结果
发酵过程中菌系ＣＭＣ酶活的变化情况见表２。由表２可知，接种后１～２ ｄ内酶活逐渐上升，大部分菌株在３～４ ｄ时酶活出现最高峰值，５～６ ｄ酶活开始下降，７～９ ｄ酶活又缓慢上升。两种菌株混合培养在一定程度上会提高ＣＭＣ酶活，组合菌株Ｎ７＋Ｎ８培养４ ｄ时的ＣＭＣ酶活为１９５．７Ｕ／ｍＬ，相当于其菌株单独培养平均酶活的２．３６倍。
表３表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况，总体的变化趋势是在１～４ ｄ内先上升，５～７ ｄ上升到峰值，之后再下降。两种菌混合培养时ＦＰＡ酶活也有一定程度的提高，组合菌株Ｎ７＋Ｎ８在发酵６ｄ时的ＦＰＡ酶活为３０．５ Ｕ／ｍＬ，相当于其菌株单独培养平均酶活的１．７倍。因此，选取组合Ｎ７＋Ｎ８作为最优纤维素降解混合菌系。
２．３组合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最适温度
分别研究了温度在２０、３０、４０、５０、６０℃时混合菌降解稻草后的ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、产还原糖量（表４）。由表４可知，ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性，三者均在温度为３０℃时达到最大值。因此选择３０℃作为混合菌降解稻草的最适温度。
２．４组合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最适ｐＨ值
分别研究了初始ｐＨ值为４．０、４．５、５．０、５．５和６．０时混合菌降解稻草后的ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、还原糖量。由表５可知，初始ｐＨ值为４．５时，ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、还原糖含量三者均达到最大值。因此选择４．５为混合菌降解稻草的最适初始ｐＨ值。
２．５组合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最适培养时间
在混合菌降解稻草的最优发酵条件下，每隔１２ ｈ测定１次其生长状况及产糖情况，研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响，结果见图1。由图1可知，混合菌系在培养７２ ｈ之前，还原糖产量较低，在培养７２～９６ ｈ过程中，混合菌系迅速产生还原糖，在９６ ｈ时还原糖产生量最高，达１．８ ｇ／Ｌ。
３讨论
本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系，该混合菌系的ＣＭＣ酶活和滤纸酶活均高于单一菌株；同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度、最适初始ｐＨ值及培养时间对还原糖量的影响。本研究虽对上述试验条件进行了探讨，但以下问题有待进一步研究：①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距，应采用诱变等方法对该菌系进行处理，以提高现有菌系的产酶活力；②在利用单因素法研究温度、ｐＨ值、培养时间对产酶的影响的基础上，需进一步研究多因素对发酵产酶的影响，以使理论研究更加贴近实际生产。
参考文献：
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