摘要：研究了黑木耳10个菌株胞外酶活性及与栽培性状和产量的关系，结果表明，胞外漆酶、多酚氧化酶活性的变化趋势大致相似，酶活与栽培产量呈正相关，相关系数为0.823（7号菌株除外），酶活性相对较高的菌株（3、4、8号），栽培中产量相对较高。纤维素酶活性高峰时间出现较漆酶、多酚氧化酶早，且酶活性高峰出现早的菌株菌丝长速较快。蛋白酶活与栽培产量呈一定负相关性，相关系数为-0.700（6号菌株除外），蛋白酶活最低的3号菌株，栽培产量最高；而活性较高的5、9号菌株栽培产量较低。
关键词：黑木耳；胞外酶活性；菌丝长速；液体培养；子实体产量；袋栽
中图分类号：S646.601；S646.604文献标识码：A
黑木耳（Auricularia auricula）子实体清脆爽口，味道鲜美，含有丰富的营养物质和生物活性物质，其广泛的食、药用价值得到越来越多消费者青睐[1]。食用菌胞外酶与栽培特性关系的研究表明，侧耳和金针菇菌丝的胞外CMC酶活力与子实体产量成正相关[2]；金针菇等食用菌在子实体形成期,需胞外为稳定的低氮环境以保证生殖生长的进行 [3]；这些研究表明，食用菌胞外酶与栽培特性存在一定的关联。开展黑木耳菌种早期性状（酶活）及栽培特性相关性等方面的研究，对菌种优劣的早期鉴定十分必要，可为品种选育、引种、菌种的鉴定和菌种保藏提供理论依据[2]。相关食用菌胞外酶活性研究报道较多[46]，而黑木耳胞外酶活变化与栽培性状比较分析尚未见报道。本试验选择10个栽培性状差异较大的黑木耳优良菌种，研究了其胞外酶活变化规律及与栽培特性的关系，现将试验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1供试菌株
黑木耳1~10号分别为8808、黑29、981、黑威2号、黑威4号、黑威5号、黑威3号、139、黑威1号、9312，其中1号为对照菌株。以上菌种均由黑龙江省科学院应用微生物研究所提供。
1.2培养基配方
液体培养基：元葱200 g（煮汁1000 mL），蔗糖10 g，阿魏酸0.06 g， pH自然。母种培养基：土豆200 g（煮汁1000 mL），琼脂粉14.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸二氢钾3.0 g，硫酸镁1.5 g，蛋白胨0.5 g，维生素B110.0 mg ，pH自然。原种培养料：99％煮熟麦粒，1％石膏。栽培培养料：木屑78%，麸皮20%，石膏2%，含水量为65%，pH自然。
1.3粗酶液制备
分别于250 mL三角瓶中装入100 mL液体培养基， 0.10 MPa灭菌20 min，冷却后每瓶中分别接入直径为5 mm的菌种6片，25 ℃静置培养，分别于不同培养时间（7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d和49 d）吸取培养液，8000 ×g， 4 ℃离心10 min，上清液为待测酶样。酶活测定设1个空白对照和3个重复。
1.4漆酶活性测定
取13.36 mmol/L邻联甲苯胺(用95%乙醇溶解)0.5 mL作为底物，加入0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH=4.6)3.4 mL和0.5 mL酶液，28 ℃下反应30 min，于600 nm处测OD值。另取同量酶液，沸水浴5 min灭活后作为对照。酶活力单位定义：以每毫升培养酶液与底物作用30 min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)[7]。
1.5多酚氧化酶（PPO）活性测定
取0.1 mmol/L的邻苯二酚2.0 mL,加入0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH=6.0)2.0 mL和0.5 mL酶液, 28 ℃下反应30 min，于400 nm处测OD值。另取等量酶液，沸水浴5 min灭活后作为对照。酶活力单位定义：以每毫升培养酶液与底物作用30 min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)[7]。
韩增华，等：黑木耳胞外酶活变化与栽培性状比较的研究
1.6羧甲基纤维素酶(CMCase)活性测定
在试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液(用pH4.6的0.1 mol/L醋酸缓冲液配制)1.5 mL，加粗酶液1.0 mL，50 ℃水浴保温30 min,取出后立即加入DNS试剂1.5 mL,于100 ℃水浴5 min,冷却后加入蒸馏水定容至25 mL,混匀, 测520 nm处OD值。另取同量酶液，沸水浴5 min灭活后，作为对照。以不同浓度的葡萄糖溶液与DNS试剂反应，测520 nm处OD值，制作葡萄糖标准曲线。酶活力单位定义：以每毫升培养液中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1活力单位(U)[8]。
1.7滤纸纤维素酶（FPase）活性测定
采用滤纸作为底物测定纤维素酶的活力，分别于酶解管中加入一条新华1号滤纸(1 cm×6 cm)，0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.5)1 mL，酶液1 mL， 50 ℃下保温30 min，取出后，立即加入DNS试剂1.5 mL， 100 ℃水浴5 min，冷却后加蒸馏水至25 mL，混匀，测520 nm处OD值。另取同量酶液，沸水浴5 min灭活后，作为对照。葡萄糖标准曲线的制作同1.6。酶活力单位定义：以每毫升培养液中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1活力单位(U)[9]。
1.8酸性蛋白酶活性测定
取0.9 mL 0.5%的酪蛋白(预热至30 ℃)于试管中，加入0.5 mL粗酶液摇匀,30 ℃保温10 min,加入1 mL三氯乙酸，摇匀静置，过滤，取0.5 mL滤液，加入3 mL 0.55 mol/L碳酸钠，0.5 mL福林酚试剂摇匀，30 ℃保温15 min，650 nm处测定 OD值。另取0.5 mL粗酶液，沸水浴5 min灭活后，作为对照。酶活力单位定义：以每毫升培养液中的酶量与底物作用10 min释放出1 μg酪氨酸为1活力单位(U)[10]。
1.9栽培试验
母种制作：2 mm×2 mm的菌种块1块接入母种培养基，25 ℃培养14 d。原种制作：原种培养料装入500 mL葡萄糖瓶，0.12 MPa灭菌2 h，冷却后接入5 mm×5 mm的母种3块，25 ℃培养14 d。栽培培养料装入17 cm×33 cm聚乙烯菌袋，每袋装干料0.3 Kg， 0.12 MPa灭菌2 h，冷却后接入原种颗粒10~15粒，25 ℃培养45 d。每个品种取50袋，分成五组，每组10袋，随机摆放。记录菌丝生长速度、子实体成熟期和平均产量。
催耳芽期每日早、晚微喷灌溉一次，要求所覆草帘湿透，菌袋上有细小水珠，地表湿润，中午通风；展片期每日早、晚微喷灌溉各一次，要求地表有少量积水并随展片程度加大喷水量，同时加大通风量。耳片8分成熟时采收，采收前一天停水。
2 结果与分析
2.1漆酶和多酚氧化酶活性
实验结果（图1）表明，胞外漆酶与多酚氧化酶活变化趋势大致相似。供试菌株酶活性最高峰值出现的时间相对较晚，除10号菌株漆酶活性高峰在第21天外，1～5号和8号、9号菌株的多酚氧化酶和漆酶活性峰值出现在35 d或42 d；6、7号菌株49 d酶活性达到最高值。3、4、7和8号菌株的胞外漆酶、多酚氧化酶活性相对较高，2、5和9号菌株酶活性水平相对较低。7号菌株酶活分泌相对较特殊，酶活性在35 d迅速升高，且一直保持较高活性水平。
2.2羧甲基纤维素酶(CMC酶)和滤纸纤维素酶（FP酶）活性
试验结果（图2）表明，纤维素酶活性升高到一定水平后有的菌株维持一段时间后酶活下降，而有的菌株到达一定酶活高度后直接下降到较低水平，之后再升高、下降。CMC酶活性较高的菌株有2、4、5和8号，FP酶活性较高的菌株有2、6、8和9号。大部分菌株纤维素酶活性峰值出现的时间较漆酶、多酚氧化酶早些。
2.3酸性蛋白酶活性
酸性蛋白酶结果如图3所示，6号菌株酸性蛋白酶活性与其它菌株差别大，酶活远远高于其它菌株，在培养的28 d时达到最大值。2、3、4和7号菌株在菌丝培养时期酶活性水平一直很低。5号和9号菌株酶活水平相对较高，并且随培养时间增长酶活逐渐升高。
2.4酶峰值时间与菌丝长速和子实体成熟期结果比较
表1表明，除5、7号菌株外，其它菌株的漆酶与多酚氧化酶的平均酶峰出现时间都长于CMC酶与FP酶的平均酶峰时间，这表明纤维素酶一般先于漆酶、多酚氧化酶被诱导。纤维素酶活性高峰较漆酶、多酚酶出现的早，这也说明纤维素先于木质素被降解利用，这与王玉万等研究有类似之处［11］。在栽培种培养基中菌丝生长速度较快的2、6和10号菌株，其CMC酶与FP酶峰值时间出现得较早。除4、6号外，蛋白酶峰时间出现的较晚。2、3和10号菌株子实体成熟时间为55 d，8号菌株为50 d，其它菌株为45 d。
2.5酶活性与栽培平均产量分析比较
漆酶与多酚氧化酶共同作用参与木质素降解［12］，CMC酶和FP酶共同作用完成纤维素分解［3］，蛋白酶参与氮源的分解［3］，实验将这三类酶的酶活性与栽培产量进行比较，结果见表2。漆酶与多酚酶总酶活含量较高的菌株为3、4、7和8号，其中7号菌株酶活远远高于其它菌株；活性较低的菌株为2、5和9号。与栽培产量相关性分析发现，除7号菌株外，漆酶与多酚氧化酶酶活之和对栽培产量的相关系数为0.823，线性方程为：栽培产量=37.743+20.834×二者酶活之和，这一分析结果表明，栽培产量与酶活间存在正相关。酶活性相对较高的菌株栽培中产量相对较高，活性较低的菌株栽培产量也较低。CMC酶和FP酶总酶活较高的菌株为2、6和8号，较低菌株为3、7和10号。与栽培产量分析未发现关联性。蛋白酶活含量较高的菌株有5、6和9号，其中6号酶活远远高于其它菌株；活性较低的有2、3、4和7号菌株。与栽培产量相关性分析发现，除6号菌株外，蛋白酶活对栽培产量的相关系数为-0.700，线性方程为：栽培产量=52.782-2.740×蛋白酶活，这一分析结果表明，栽培产量与酶活间存在着负相关性。活性较高的5、9号菌株栽培产量较低，而活性最低的3号菌株栽培产量最高。
3 讨论
漆酶和多酚氧化酶是与木质素等大分子物质降解有关的主要酚氧化酶，是一种含铜的糖蛋白，它能加速木质素芳香族高分子化合物的分解，为菌株提供丰富营养［12］。胞外漆酶、多酚氧化酶与分解木质素能力呈正相关，酶活高、低代表该菌株分解木质素能力的强、弱。本实验研究表明，胞外漆酶与多酚氧化酶活性表现出分泌趋势大致相似，这与报道中漆酶、多酚氧化酶都是木质素等大分子降解酶，它们共同作用进行大分子物质分解相一致［13］。胞外漆酶、多酚氧化酶活性与产量分析结果发现，酶活较高的3、4、8号菌株栽培产量也较高，而酶活较弱的2、5、9号菌株栽培产量相对也较低。7号菌株酶活一直保持较高水平，栽培实验中此菌株出耳快、周期短，产量集中，但产量相对较低，分析原因可能是过量的酶分泌造成基质营养过量消耗，栽培生产中营养过耗而使碳氮比失衡，造成出耳产量下降。
纤维素酶是一种复合酶［14］，由羧甲基纤维素酶和滤纸纤维素酶等酶组成。菌种以分解基质中的纤维素、半纤维素、木质素来满足其生长繁殖所需要的营养，而这些大分子物质需在纤维素酶的作用下才能够分解［3］。本文对黑木耳菌株的纤维素酶活性研究发现，黑木耳菌株均可分泌降解纤维素的纤维素酶，降解水平存在一定的差异。研究结果表明，CMC酶活力与产量无相关性，但发现纤维素酶活性高峰出现较早的菌株，菌丝在培养料中长速较快，这一结论与李娟等的研究结果一致［15］。
蛋白酶是在基质中氮源有限的情况下，为获得蛋白质中的氮素而产生的。研究发现蛋白酶活性与产量存在一定负相关，这些研究结果与宋爱荣等的报道相一致［3］。而研究中也发现一些特殊性，如6号菌株蛋白酶活性远远高于其它菌株，栽培中产量并不是很低。其原因可能是某些菌株代谢调控还受到其它重要因子控制，或栽培中受到栽培环境和气候的影响，在栽培产量和栽培特性分析上出现较大偏差，此现象还有待深入研究。
研究表明胞外漆酶、多酚氧化酶、纤维素酶、酸性蛋白酶分泌酶活性高峰早、晚，活性高、低，与栽培性状中的菌丝长速和产量存在一定关联性。通过酶活与栽培特性比较分析，建立栽培性状指标与酶分泌规律的相关联系，为栽培性状定向育种提供基础信息，此法的成功研究可充分缩短育种时间，达到在短期内选育出适应市场的栽培品种，为优良菌种选育提供可靠依据。
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朱丽娜
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