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摘要：为明确生防菌株JX-13的分类地位，评价其对草莓枯萎病的生防效果，依据JX-13菌株形态、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因碱基序列同源性对其进行分析鉴定，采用菌丝生长速率法和田間试验评价其对草莓的促生作用和枯萎病生防效果。结果表明，JX-13菌株的形态特征和生理生化特性均与芽孢杆菌很接近，16S rRNA和gyrB基因碱基序列分析发现，JX-13菌株在系统发育树中与Paenibacillus polymyxa strain IIF5SW-B3属于一个类群，相似性高达99.00%。发酵加工的lxl010CFU/g JX-13可湿性粉剂（WP）和lxl010CFU/g枯草芽孢杆菌WP对草莓枯萎病菌菌丝生长的抑制中质量浓度（EC50）分别为19. 977μg/ml和41. 409μg/ml。对草莓繁苗田进行2次灌根处理，JX-13 WP 500倍液处理对草莓植株有明显促生作用，对草莓枯萎病的防治效果达96.03%。定植当天和第7d对定植田进行2次灌根处理，药后50 d、80 d分别进行田间调查，JX-13 WP 500倍液对草莓枯萎病防治效果分别为100.00%和68.94%。菌株JX-13被鉴定为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，其发酵液加工的lx 1010CFU/g WP在草莓繁苗田和定植田中具有防治枯萎病和促生的作用。
关键词：草莓枯萎病;拮抗细菌JX-13菌株;促生作用;生防效果
中图分类号：S668.4
文献标识码：A
文章编号： 1000-4440（2019）03-0586-08
草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一种高价值经济作物，在中国种植广泛[1-2]，已成为许多地区的支柱产业。2017年，中国的草莓种植总面积达到1.5x105 hm2，总产量约4.Ox106 t，总产值已超过6.Ox1010元。在草莓生产中，由于耕地有限，通常采取连年种植的栽培方式，但随着种植茬口的增加，土壤出现盐渍化、酸化和土壤微生态失衡等问题[3]。草莓对土生真菌，如疫霉菌属（Phytophthora spp.）、腐霉属（Pythium spp.）、丝核菌属（Rhizoctonia spp.）、镰刀菌属（Fusarium spp.）、轮枝菌属（Verticillium spp.）等多种病原菌敏感[4]，而连作会使病害加重，造成草莓生长发育迟缓，匍匐茎减少，结果减少，果实膨大受阻，品质下降，甚至全株枯死等危害[5]。有研究结果表明，草莓连作种植时，第二年重茬草莓发病率达55.0% - 91. 6%[6]，草莓的连年种植模式严重制约了草莓产业的健康发展[7]。
草莓枯萎病是由半知菌亚门瘤座菌科尖孢镰刀菌草莓专化型Fusarium oxysporum±.sp. fragariae引起的重要土传病害，病原菌从根部侵染引起维管束病变，导致草莓品质降低，甚至全株枯死[8]。目前，对该病害的防治仍以化学防治为主，常在根部施用恶霉灵、代森锰锌、多菌灵和甲基托布津等杀菌剂[9]。杨焕青等[10]的研究结果表明，草莓枯萎病菌对三唑类杀菌剂烯唑醇、戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲环唑十分敏感。单一化学药剂长期使用导致病原菌抗药性增强，农药残留超标，环境污染[11-12]。由于生防菌具有成本低和对环境友好的特点[13-19]，利用生防菌防治植物的土传病害已成为国内外科研工作者的研究热点。项目组前期从句容地区石楠根部筛选了1株具有广谱抑菌效果的生防株菌JX-13，本研究拟根据其菌体形态特征、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列对其进行鉴定，并对菌液进行加工，以期为草莓枯萎病的防治提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 草莓枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp. fragariae）由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供。生防菌株JX-13从句容地区石楠根部分离获得。
1.1.2 培养基Luria-Bertani培养基用于生防菌株JX-13的分离、鉴定、保存和培养‘20]，马铃薯培养基（PDA）用于草莓枯萎病菌的培养和毒力测定[21]。
1.2 方法
1.2.1 生防菌株JX-13的形态学鉴定 革兰氏染色、菌体形态和菌落形态的观察参照杜秉海[22]的方法进行。菌株生理生化反应参照《常见细菌系统鉴定手册》[23]进行。
1.2.2 生防菌株JX-13的分子鉴定在液体马铃薯培养基中，30℃下振荡培养JX-13菌株至对数生长期，10 000 r/min离心10 min，收集菌体。细菌基因组DNA提取参照Ausubel等[24]的方法，采用细菌通用引物（27F：5 "-AGAGTTI"GATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5 "_GGrITACCTTGrITACGACTT_3"）进行PCR扩增。以细菌基因组DNA为模板，对gyrB基因碱基序列进行PCR扩增，引物序列为UP-1S：5’一GAAGTCATCATGACCGrITCTGCA_3"， UP-2Sr：5 "-AG-CAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’，PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将16SrRNA基因碱基序列和gyrB基因碱基序列结果提交至美国国立生物技术信息中心（NCBI），通过BLAST进行同源性比对，利用MEGA 7.0软件构建JX-13菌株系统进化树（ Bootstrap=1 000）。
1.2.3 JX-13茵剂的加工
1.2.3.1 菌液的获得用无菌牙签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的JX-13菌株单菌落，接种于装有5 ml PDA液体培养基的容积为20 ml的三角瓶中，于30℃、200 r/min条件下振荡培养16h，将所得5 ml培养液全部接种于装有400 ml PDA培养液的容积为1 000 ml的三角瓶中，200 r/min、30 cC条件下振荡培养16 h。将所得的400 ml培养液接种于装有20 L培养液的容积为30 L的发酵罐（产品型号：GUS-30，镇江东方生物工程设备技术有
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