材料
1.1 动物 SPF级雄性C57BL/6J小鼠60只，6～8周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2 细胞系 小鼠CRC肝转移细胞系SL4，由中国科学院基因所刘斯奇教授惠赠。
1.3 药物 复方环磷酰胺片（天津金世制药有限公司，批号20101201）；熊胆粉（福建归真堂药业股份有限公司，批号20090803），由北京中医药大学东方医院李军祥教授提供。
1.4 试剂与仪器 DMEM/F12培养基、胎牛血清等购自美国Hyclone公司；CD45，PerCP，Cy5.5，CD3e，FITC，CD4，PE，Cy7，CD8a，APC，Cy7，NK1.1，PE，CD45R/B220，APC，CD11c，FITC，CD11b，APC，Cy7，Ly，6C，APC，Ly6A/E，PE，Cy7及同型对照均购自美国BD Pharmingen公司；F4/80，PE购自美国eBioscience公司；FACS Lysing Solution红细胞裂解液购自美国BD Pharmingen公司。CM1950石蜡切片机（德国LEICA公司）；ECLIPSE 90i显微镜和NIS，Elements F3.0分析软件（日本Nikon公司）；LSRFortessa流式细胞仪（美国BD公司）。
2 方法
2.1 SL4细胞系体外培养 将液氮保存的SL4细胞取出，迅速放入37 ℃水浴中解冻，1 000 r·min-1离心5 min，PBS重悬，洗涤后，置37 ℃，5%CO2培养箱，以10%胎牛血清的DMEM/F12培养基孵育培养，经换液传代至对数生长期，调整细胞到1×107个/mL，用于小鼠体内实验接种，接种时每只小鼠注射100 μL。
2.2 动物分组 共分为5组：模型对照组、环磷酰胺组（CTX，80 mg·kg-1）、环磷酰胺+熊胆粉高剂量组（CTX+HB，300 mg·kg-1）、环磷酰胺+熊胆粉中剂量组（CTX+MB，150 mg·kg-1）、环磷酰胺+熊胆粉低剂量组（CTX+LB，75 mg·kg-1）。于接种手术完成后第2天开始每天口服灌胃中西药混合液，模型组灌服等量生理盐水。
2.3 造模 按照本实验室改良的脾脏原位造模方法[2]接种SL4结直肠癌细胞，制作肝转移模型。60只动物全部实施接种手术，第2天开始连续灌胃给药，每日密切观察，隔天称1次体重，于接种后第13天处死小鼠。
2.4 动物称重、取材以及肝脾脏器大体观察 接种SL4细胞后第13天，所有小鼠称体重，采用摘除眼球法取血，以肝素抗凝（终浓度20 U·mL-1），混匀后室温放置，统一进行荧光染色；解剖肝脾组织，观察肿瘤生长及转移情况，测量肿瘤大小并称量肝脾质量；取部分脾脏组织和肝脾肿瘤制备单细胞悬液，4 ℃保存。
2.5 组织病理学观察 将剩余肝脾组织置于10%甲醛溶液中固定，制作石蜡切片，进行HE及免疫荧光染色，显微镜下观察病理学改变。
2.6 小鼠外周血、脾脏组织和肝脏转移肿瘤组织免疫细胞分析 外周血用红细胞裂解液（FACS lysing solution）裂解红细胞，脾脏组织和肝脏转移瘤组织经剪碎研磨，制成单细胞悬液，然后分别进行荧光抗体染色。每只动物每个组织2管，每管分别加入如下抗体：①CD3e，FITC/NK1.1，PE/CD45，PerCP，Cy5.5/CD4，PE，Cy7/CD45R/B220，APC/ CD8a，APC，Cy7；②CD11c，FITC/F4/80，PE/CD45，PerCP，Cy5.5/Ly6A/E，PE，Cy7/Ly6C，APC/ CD11b，APC，Cy7；然后加入100 μL各组织样本，充分混匀，室温避光染色30 min；PBS洗涤后，以1%多聚甲醛固定，流式细胞仪分析免疫细胞表型变化。
2.7 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行处理，实验数据以±s表示，各组样本均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 动物整体观察 术后1～2 d，小鼠精神状态欠佳，活动及摄食量减少，体重略有下降，由于动物相互间抓挠，导致腹部破裂死亡4只。第3天后活动逐渐增加，体重逐渐恢复，至第5天前后达到术前水平。除手术后腹部破裂死亡的4只动物外，所有接受脾脏原位接种SL4细胞移植术的小鼠，均发生肝脏肿瘤转移。术后第11天模型组由于腹部肝转移肿瘤巨大死亡2只，死亡小鼠肝脏肿瘤组织几乎充满整个腹脏，腹部解剖见图1。第12天又有模型组及给药组动物死亡，因此第13天进行取材处理动物。取材时生存情况见表1。
3.2 肝脾组织质量比较 取材当日，眼球取血后处死动物，解剖小鼠腹部，观察肿瘤生长及转移情况，取肝脾组织，测量肿瘤大小并称量肝脾质量。统计结果表明，肝脾质量各给药组与模型组比较均有统计学意义（P<0.05），见图2。
3.3 HE染色及免疫荧光分析 肝脾组织进行HE染色后光镜下可见大量肿瘤细胞浸润，炎症细胞增多，见图3。取肿瘤组织进行F4/80免疫荧光染色，可见肿瘤组织中富集大量巨噬细胞，见图4。
3.4 流式细胞分析熊胆粉联合CTX治疗后CRC肝转移小鼠肿瘤炎症微环境中免疫细胞表型变化 小鼠取材当日，取肝素抗凝血100 μL，裂解红细胞后以荧光抗体染色，进行流式细胞测定，分析免疫细胞百分含量。结果表明，熊胆粉联合CTX治疗后比CTX单独用药，升白作用显著，T淋巴细胞升高较为明显，以熊胆粉低剂量组（CTX+LB）差异最显著，CD3+细胞由73.1%升到78.5%，主要是T辅助细胞升高明显，CD3+CD4+细胞由48.8%升至61.2%（P<0.05），而CD3+CD8+由24.3%降至17.3%（P<0.05），由此提高了CD3+CD4+/CD3+CD8+比值，增加了机体免疫力；B细胞与模型组比下降明显（P<0.05），与CTX比无差异；F4/80+CD11c+明显升高，见图5。
脾脏原位接种SL4细胞，于第13天取材，近一半脾脏被肿瘤组织包裹，肉眼观察选取无肿瘤块的脾组织，研磨成单细胞悬液，荧光抗体染色，流式细胞分析免疫表型变化。结果显示，熊胆粉联合CTX治疗后，比单独CTX治疗组淋巴细胞总数明显增加，由47.8%增至66.5%（P<0.05），B细胞增加较为显著，由34.2%升高到48.2%（P<0.05），NK细胞表现为降低；以CD45设门，分析单核巨噬细胞表达，CD11b，F4/80及CD11c明显降低（P<0.05），同样以CTX+LB组炎细胞降低最为显著，见图6。
肝转移肿瘤制备成单细胞悬液后，进行免疫荧光染色，分析熊胆粉联合CTX治疗后，肿瘤微环境炎症细胞浸润状况。结果显示，联合治疗与单独CTX治疗比较，在CD45+细胞中，单核巨噬细胞总数下降明显，CTX+LB作用较为显著，由78.1%降至57.7%（P<0.05），CD11c细胞由51.7%降至22.5%（P<0.05），降低1.3倍；F4/80+CD11c+细胞由35.0%降至16.7%（P<0.05），降低1.1倍，见图7。
4 讨论
针对 CRC 术后容易转移和复发的特点，西医一般实施放化疗治疗，虽然有一定的疗效。但由于放化疗辨别能力较差，副作用也相对较大，如骨髓抑制，白细胞下降，免疫功能低下，至使机体抵抗力明显降低，进而加剧了脏器转移的风险。中医中药治疗是我国的特色治疗，中医辨证论治CRC，不仅能够很好的抑制癌细胞，杀灭癌细胞，而且可以增强机体的免疫功能，改善胃肠道和肝脏的功能，调达津液亏损，改变机体整体现状，帮助身体康复。本研究应用熊胆粉联合CTX治疗，不仅起到了良好的治疗效果，增强了机体免疫力，更重要的是提高了生存率。如表1所示，生存率由单独CTX治疗的66.7%提高到88.3%。
熊胆粉为熊科动物黑熊采用新技术活体引流胆汁而得的干燥品，临床作为熊胆药物使用，属国家卫生部批准的一类新药[卫生部药品标准 WS3，09 （B，09），96 （Z）][4]。出于对国家二级动物“黑熊”的保护，沈阳药科大学成功研制了“人工熊胆”，其化学组成、理化性质、稳定性等均与天然熊胆一致，为拓展研究熊胆粉的功用提供了条件。现代药理学研究证明，熊胆粉具有保肝利胆、抗炎抑瘤、提高机体免疫力等作用[5，7]，本研究同样证实了此结果，研究表明，熊胆粉不仅具有保肝增免作用，还具有抗肿瘤转移以及调控肿瘤微环境作用。
肿瘤微环境是近年来国内外癌症研究中，广泛关注的一个新的治疗靶点和研究方向[8]。主要由肿瘤细胞本身和肿瘤局部所浸润的免疫炎症细胞、间质细胞及其分泌的活性介质等组成，它们共同参与肿瘤的发生、发展和转移[9]，其中免疫炎症细胞起关键性作用，主要是肿瘤浸润性白细胞，包括淋巴细胞和髓系细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等）。研究表明，来自血液的肿瘤浸润炎性细胞具有调节肿瘤微环境的作用，破坏免疫系统对肿瘤细胞的免疫监视功能，通过分泌细胞因子和细胞间的相互作用促进肿瘤血管新生，改变肿瘤细胞对激素以及抗肿瘤药物的反应，促进恶性细胞的增殖和转移[10，11]。因此，调控肿瘤微环境中浸润性炎症细胞，降低其表达或分泌，对抑制肿瘤转移意义重大。本研究应用熊胆粉联合CTX治疗CRC肝转移模型小鼠，以流式细胞术分析外周血、脾脏以及肝转移肿瘤中炎症细胞浸润状况，结果表明，低剂量熊胆粉（75 mg·kg-1）与CTX联合用药组降低炎症细胞浸润作用最为明显，肝转移组织中CD11c细胞由51.7%降至22.5%（P<0.05），降低1.3倍；F4/80+CD11c+细胞由35.0%降至16.7%（P<0.05），降低1.1倍。由此推测熊胆粉与CTX联合用药可能通过调控肿瘤微环境，减少对单核巨噬细胞以及树突状细胞等的募集，起到抗炎进而抗肿瘤转移的作用。本课题后续工作将进行功能性研究，通过信号通路，寻找影响转移的分子靶点。
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Study on inhibitory effect of combined administration of bear bile powder and
cyclophosphamide on colorectal cancer liver metastasis by
regulating tumor microenvironment
CUI Wei， LIU Sa， YANG Min， ZHANG Ting， CAI Lun， QIU Shu，lan， ZHENG Jiao， MIAO Yan，ju， ZHAO Li，min， DU Jie*
（Beijing Anzhen Hospital Affiliated to Capital University of Medicine， Beijing Institute
of Heart Lung and Blood Vessel Disease， Beijing 100029， China）
[Abstract] Objective： To explore the inhibitory effect of combined administration of bear bile powder （BBP） and cyclophosphamide （Cytoxan， CTX） on colorectal cancer liver metastasis by regulating tumor promotion inflammation microenvironment. Method： The CRC liver metastasis mode in mice was established through in situ spleenic injection of SL4 tumor cells into spleens. The mice were randomly divided into 5 groups： the model group， the CTX （80 mg·kg-1） treatment group， the CTX+BBP high dose （300 mg·kg-1） group， the CTX+BBP middle dose （150 mg·kg-1） group and the CTX+BBP low dose （75 mg·kg-1） group. Mice were orally administered with drugs for 12 days， and sacrificed on the 13th day for weighing their spleens and lives， HE staining， and immunofluorescence analysis. Their peripheral blood， and metastatic tumor in spleens and lives were analyzed with flow cytometry. Result： Spleen and liver weights of the CTX treatment group and other doses groups were significantly lower than that of the model group. HE staining and immunofluorescence analysis showed that lymphocyte infiltration was detected in normal tissues， and macrophages infiltration was observed around the tumor tissues. Flow cytometry analysis showed that the number of T，lymphocytes in peripheral blood of different doses groups were much higher than that of the CTX treatment group （P<0.05）， with the rise in the ratio of CD4/CD8； the total number of lymphocytes in spleen cell suspension increased in different doses groups， compared to the CTX treatment group， with notable increase in B cells （P<0.05） and significant decrease in CD11b， F4/80 cells （P<0.05）. The combined treatment showed less monocyte macrophages in liver metastasis than that of the CTX treatment group. Conclusion： The combined treatment of bear bile powder and cyclophosphamide has the effect in not only protecting liver and increase immunity， but also in anti，inflammation and anti，tumor by regulating tumor microenvironment and reducing the collection of mononuclear macrophages. Particularly， the combined administration of low dose of bear bile powder and CTX shows the most significant effect in reducing inflammatory cell infiltration.
[Key words] bear bile powder； cyclophosphamide； colorectal carcinoma； liver metastasis； tumor microenvironment
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