参芪抑瘤方药物血清对胃癌MKN—45细胞周期阻滞及抗侵袭转移的影响

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1.1 动物

60只SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学科研中心动物实验室，合格证号SYXK（甘）2001-0001。室温20～25 ℃、湿度45%～55%分笼饲养，喂标准饲料（甘肃中医药大学科研中心动物实验室提供），自由饮水。

1.2 药物和细胞

参芪抑瘤方由苦参、黄芪、山慈菇、全蝎、当归、浙贝母等组成，所有饮片购自甘肃中医药大学附属医院中药房，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室杨扶德教授鉴定符合《中华人民共和国药典》规定。胃癌MKN-45细胞，中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基（Gibco公司），四季青胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（Gibco公司），二抗（中杉金桥生物技术有限公司），RNAisoTMPlus（D9810A），the PrimeScript RT reagent、kit（DRRO37A），SYBR Premix Ex TaqTM（DRR081A，TakarBio），国产分析纯试剂（北京化学试剂公司）。细胞培养箱（上海申力，HF212），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5804R），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，CKX41+DP21），流式细胞仪（美国COULTER EPICS XL）。

2 实验方法

2.1 分组、给药及药物血清制备

将60只SPF级Wistar大鼠随机分为对照组和参芪抑瘤方低、中、高剂量组，每组15只。参芪抑瘤方低、中、高剂量组予0.25、0.50、1.00 g原药材/mL药液灌胃，对照组予等量饮用水灌胃。给药体积均为1.5 mL/100 g，每日2次，连续7 d。末次灌胃2 h后取血，3000 r/min低温离心15 min，分离血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，56 ℃、30 min灭活，-80 ℃保存。

2.2 细胞培养

MKN-45细胞经常规传代培养，采用含10%灭火胎牛血清及青链霉素（100 U/mL）的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中贴壁生长，每2～3 d换液1次。倒置显微镜下观察细胞情况，当生长状态良好且铺满瓶底时，采用25%胰酶消化、传代，并取处于对数生长期细胞进行实验。

2.3 流式细胞术检测MKN-45细胞周期

取对数生长期的MKN-45细胞接种于6孔板中，增殖为80%时，加入20%药物血清处理48 h，检测前用胰酶消化，1500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃固定过夜。用PBS配制成单细胞悬液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室温染色30 min后，流式细胞仪分析细胞周期。

2.4 免疫组化检测MKN-45细胞COX-2、PTEN蛋白表达

将无菌10 mm×10 mm的24片盖玻片置入24孔培养板中，取对数生长期的MKN-45细胞消化后，制成单细胞悬液，以500 μL/孔接种于24孔培养板中。待细胞贴壁后，对照组加50 μL完全培养基，余孔依次加空白血清和高、中、低剂量药物血清各50 μL，每组设3个复孔。细胞爬满盖玻片后，取爬片浸入4%多聚甲醛中过夜。用PBS洗3次，5 min/次，加50 μL 0.1%Triton X-100室温下孵育15 min后，再用PBS洗5 min×3次，加3%H2O2室温下孵育30 min，继续用PBS洗5 min×3次，滴加50 μL 5%BSA封闭液。室温封闭20 min后，甩去多余液体，滴加50 μL稀释过的Rabbit Anti-collagen TypeⅡ（1∶100），置湿盒中4 ℃孵育过夜。并以PBS代替一抗，作为阴性对照，PBS洗3次，2 min/次，加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，再用PBS洗2 min×3次。然后加SABC，37 ℃继续孵育20 min，PBS洗5 min×4次。DAB显色，自来水冲洗1 min。苏木素复染5 min，0.5%盐酸乙醇分化10 s，氨水返蓝10 s。梯度乙醇脱水干燥，每一梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差显微镜观察爬片，每组选6张爬片，每张爬片选择3个高倍视野照相，用Leica Qwin病理图像分析系统对所拍照片进行分析，测定相对灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，根据方差齐性检验结果，多组间比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

4 结果

4.1 参芪抑瘤方药物血清对MKN-45细胞周期的影响

10%浓度药物血清处理后MKN-45细胞较对照组细胞G0/G1期比例升高，S期低于对照组，见表1、图1。表明药物血清可有效抑制细胞进入增殖周期，降低细胞S期，阻滞细胞于G0～G1期。

4.2 参芪抑瘤方药物血清对MKN-45细胞COX-2、PTEN蛋白表达的影响

对照组细胞COX-2以强阳性和阳性表达为主，而药物血清干预组细胞着色逐渐变浅，COX-2呈弱阳性或阴性表达；对照组细胞着色较浅，PTEN呈弱阳性或阴性表达，药物血清干预组细胞着色逐渐变深，PTEN表达逐渐增强，呈强阳性或阳性表达，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2、图2和图3。

5 讨论

胃癌的发生、发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程。正常情况下，胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡之间保持动态平衡。这种平衡的维持有赖于癌基因、抑癌基因及一些细胞因子等共同调控。多种因素会影响上述调控体系，共同参与胃癌的发生。

中医认为，胃癌是牵涉整体的全身性疾病的局部表现，多由先天禀赋不足、邪毒侵袭、痰凝血瘀等因素，引起机体阴阳失衡，脏腑经络功能失调，进而导致局部癌变。其主要病机为本虚标实，本虚为素体虚弱或先天禀赋因素，标实不外乎气滞、血瘀、痰凝、毒聚。中医药治疗在个体化、多层次、多靶点控制肿瘤生长、抗转移、减少复发等方面具有独到的优势，是胃癌的重要辅助治疗方法。胃癌早期采用中西医结合治疗，可有效逆转病情的恶化。利用中医药的整体调节作用，胃癌术后放化疗过程中，使患者对放化疗药物的耐受性增强，免疫功能得到提高，抑瘤效果得以强化，痛苦明显缓解，生存期延长，生活质量提高。

COX-2是前列腺素合成关键限速酶环氧合酶的一种亚型，近年来研究发现，COX-2高表达与肿瘤发生发展密切相关，在肿瘤细胞增殖、凋亡过程中起重要作用，其表达可延长癌细胞的生存期，促进肿瘤细胞侵袭转移。在正常胃黏膜COX-2几乎不表达，而在胃癌变时则过表达，对胃癌细胞的异常增殖、细胞凋亡、抑制血管形成及转移复发有重要生物学作用。COX-2过表达可上调黏附因子、基质金属蛋白酶等促进肿瘤细胞发生浸润与转移；上调肿瘤细胞周围血管生成因子，促进肿瘤血管生成。研究表明，其在正常胃黏膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎伴肠化、不典型增生及胃癌组织中的表达呈逐渐递增趋势[9]。

作为抑癌基因的PTEN低表达会激活PPI3K-Ark 信号通路，从而缩短细胞的分裂周期，促进细胞增殖，与肿瘤细胞浸润、转移密切相关[10]。PTEN的表达过低、受到抑制或缺失都会诱导肿瘤细胞的无限增殖，从而促进肿瘤的发生[11-13]。PTEN蛋白的表达与淋巴结转移、侵袭程度密切相关。胃癌组织中PTEN蛋白的检测可了解与判断肿瘤增生、侵袭及转移的能力和程度。

综上，参芪抑瘤方药物血清能明显阻滞胃癌细胞于G0/G1期，减少S期细胞数量，有效抑制细胞进入增殖周期，诱导胃癌细胞周期阻滞。参芪抑瘤方药物血清可能通过抑制COX-2的表达从而抑制血管内皮生长因子的活性，降低细胞间E-钙黏蛋白活性，减弱肿瘤细胞的侵袭能力，也可能通过升高PTEN的表达量，使其去磷酸化作用增强，进而抑制细胞周期，诱导细胞凋亡和分化，抑制肿瘤细胞转移等，从而发挥抗胃癌细胞侵袭转移的作用。

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