摘 要: 目的:运用蛋白质组学的理论和方法来研究中小强度有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质 组的影响。方法:将20只SD雄性大鼠随机分 为对照组和运动组(各1组,每组n=10)。采用中小强度运动负荷跑台训练建立运动实验模 型,提取右心室肌组织全蛋白样品,采用双向凝胶电泳进行蛋白样品分离。运用ImageMaste r 2D Platinum图像分析软件对2-DE胶进行分析,通过图像分析,选取运动后差异表达量≥5 倍的蛋白点,用串联飞行时间质谱蛋白质仪(ULGRAFL-FLEX-TOF/TOF)进行质谱鉴定。结果 :经过8周运动后,在2-DE图谱上运动组和对照组检测到的蛋白质点分别为(547±18)个和(5 30±14)个,匹配率分别为(71.34±3.25)%和(70.28±2.38)%。运动后共有58个蛋白质 点发生了变化:表达量上调≥2倍的点有33个,下调≥2倍的点 有25个,其中上调≥5倍的点有8个,下调≥5倍的点有8个。选择差异表达量≥5倍的蛋白质 点为目标蛋白质进行质谱分析,共鉴定出了5个差异表达蛋白质点。结论:在长期中小强度 有氧运动后,大鼠右室肌蛋白质组发生了明显的差异性表达,这些差异性表达的蛋白质点为 进一步观察在运动应激状态下对心脏结构与功能影响的新的目标蛋白质提供了实验依据。
关键词:蛋白质组;右心室肌;中小强度有氧运动;双向凝胶电泳;质谱鉴 定
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编 号:1007-3612(2010)10-0048-04
The Research of Different Expressions of Right Ventricular Muscl e Proteome after Moderate and
Small Intensity Aerobic Exercise in Rats
XU Zhe1,SHI Shao-Rong1,TAN Jun2,GUO Yuan-Pan1,WANGJuan1
(1 Physical Department of Hunan Normal University, Changsha 4 10082,Hunan China;
2 People"s Hospital of Hunan Province, Changsha 41 0005, Hunan China)
Abstract: objective: Proteomic methodology was used to study the influence of Moderate andsmall intensity aerobic exercise on the right ventricle proteins in rats.Methods: 20 rats were divided intorest and exercise groups in random The exercise group was set up to do treadmi l l training with medium and small intensity exercise and then killed to extract t he total protein of right ventricular muscle for two dimensional gel electrohore sis searation The spots in different expression volume more than 5 times are s elected as alternative spots for mass sectra (MS) identification The gels mapswere analyzed with the ImageMaster 2D Platinum image analysis software to choos e variable proteins and the chosen proteins were identified by ULGRAFL-FLEX-TO F/TOF Results: After 8 weeks" training, in electrophoresis map, the average nu mber of detected protein spot in rest group and exercise group are respectively530±14 and 547±18,and the match ratio are respectively(70.28±2.38)% and(71 34±3.25)% There are 58 changed after exercise: 33 increased expres sion more than 2 times; 25 decreased expression more than 2 times Protein spot s of differential expression more than 5 times were selected as object proteinumin MS identification and 5 protein spots of which were assess Conclusion: rig ht ventricle protein were obviously variously expression after long term moderat e and small intensity aerobic exercise, it provides sufficient experimental base s in its further study.
Key words: proteome;right ventricular muscle;medium and small intensit y aerobic exercise;two dimensional gel electrophoresis;MS/MS
心肌蛋白质是构成心脏结构中最重要的部分,是完成泵血功能的直接执行者。大量的研 究表明,经过长期系统的运动训练后,心肌结构和功能发生变化,这必然导致心肌蛋白质的 表达量和质发生变化。在运动应激状态下右室肌组织中的蛋白质会在表达量和构象上发生时 间和空间的变化,这种变化将根据运动强度、时间、方式的不同而具有动态变化的特点。本研究通过复制中小强度有氧运动的动物模型,以及蛋白质组学中的2-DE、质谱等核心技术来 研究在中小强度有氧运动过程中右室肌蛋白质组差异表达的动态变化及其规律,初步筛选出 对运动应激具有重要意义的目标蛋白质,为深入研究国民体质健康的运动干预,也为慢性心 血管疾病的运动康复提供实验依据。
投稿日期:2009-11-27
基金项目:湖南省科技厅计划项目(2007FJ3075)。通讯作者:史绍蓉 。
作者简介:徐哲,硕士研究生,研究方向运动心脏与蛋白质组学。 1 材料与方法
1.1 研究对象和分组 20只雄性Sprague-Dawley大鼠购于湖 南农业大学实验动物部,2月龄,体重为(232±8.3)g,Ⅱ级试验动物。室温20～24℃,相 对湿度45%～55%,光照时间为7:00～19:00,按国家标准啮齿类动物饲料分笼喂养,自 由进食和饮水,适应性喂养一周。20只大鼠按体重配对随机分为对照组和运动组,每组10只 。
1.2 实验动物建模方案 实验动物模型参考Hsieh Y.Y.和 Bedford的运动动物模型[1,2]。进 行跑台适应性训练5 D,运动强度分别为:第一天是10×10 m/min、第二天是10×15 m/mi n、第三天是18×15 m/min、第四天是21×20 m/min、第五天是24×20 m/min,此后每天以 速度为24 m/min训练40 min,负荷强度相当于60%～70%V•O2max,共 训练8周。整个运动过程中,每周运动6 d,周六休息1 d。
1.3 样品制备
1.3.1 取材 运动组于训练第8周末次运动后6 h与对照组同时 称重,麻醉后打开胸腔,用生理盐水对心脏进行灌流后,迅速取出心脏,用4℃生理盐水中 进行冲洗,用滤纸小心吸干水分称取心脏重量,剪取右心室肌组织,置液氮中贮存备用 [3,4]。
1.3.2 蛋白提取 蛋白提取方法参照相关文献[5,6]。 然后用 Bradford法对样品进行蛋白定量[7],测得对照组蛋白含量为31.65 μg/μL,运 动组蛋白含量为32.13 μg/μL。样品每管1 mg分装后,-70℃冰箱保存待用。
1.4 固相PH梯度-SDS双向凝胶电泳方法与图像分析 参考Go rg[8]的方法和IPGhorTM等电聚 焦系统操作指南进行蛋白质固相-pH梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)。凝胶染色采用改良的 考马斯亮蓝染色[9]。运用清华紫光D3000图像扫描仪透射扫描凝胶。所得图谱借助 图像分析 软件ImageMaster 2D Platinum进行详细分析、比较蛋白质斑点差异。蛋白质分子的等电点 和分子质量根据Marker和IPG胶条pH标识范围和标准蛋白质用软件自动计算。
1.5 质谱分析质谱分析采用考马斯亮蓝胶胶内原位酶解制备质谱分析样品。用串联飞行时 间质谱蛋白质仪(ULGRAFL-FLEX-TOF/TOF)做蛋白质的质谱鉴定,然后选取一级质谱的肽质 量指纹图谱上峰值较高的肽段峰进行二级质谱鉴定,以对一级质谱鉴定的蛋白质进行进一步 的确证。
1.6 统计学处理 蛋白质点的数目和心重指数的统计用平均数 ±标准差表示。表示胶上的蛋白质点数目的集中趋势,S表示其离散程度。
2 结 果
2.1 大鼠心脏重量 大鼠经过8周中小强度有氧运动后与对 照组相比,心脏重量增加百分率为1.7%,而心脏重量指数增加32.0%,详细数据见表1。
2.2 运动后大鼠右心室肌2-DE图谱的差异表达 图1分别为8周对照组和运动组大鼠右心室肌 蛋白质经双向凝胶电泳后得到的代表图谱。通过ImageMaster 2D Platinum软件分析,运动 组和对照组蛋白质斑点数目分别是(547±18)个和(530±14)个,匹配率分别为(71.34 ±3.25)%和(70.28±2.38)%。
经软件分析,运动组与对照组相比,蛋白质表达量变化≥2倍的点共有58个,其中,表达上 调的点33个,下调的点25个,分子量分布广泛,位于15～110 KDa范围,等电点在5.0～8 0范围内。
表1 运动组与对照组心脏重量及心重指数统计
实验组对照组 变化率/%心脏重量/g1.17±0.141.15±0.141.7心重指数/mg•g-12.98±0.34*2.25±0.2032.0注:*表示p<0.05 与对照组相比。
图1 对照组(左)和运动组(右)大鼠8周后
右心室心肌蛋白质2-DE图谱 软件分析显示,8周运动后未出现“缺失”或“新增”的点。表达量变化≥5倍的点有16个, 其中,上调的点8个,下调的点8个。从表2、3中可以看出,这些点的分子量在14～85 KDa之 间,更多的集中在30～60 KDa,而等电点在5.0～10范围内。整体来看,运动8周后发生显 著变化的点集中于5.0～8.0范围内。
表2为8周运动后大鼠右心室肌表达量上调≥5倍的蛋白质点的分子量(Mr)和等电点(pI)值 。
表2 8周运动后差异表达量上调≥5倍的蛋白质点
SSPMr/KDa pIFolds35143.878.495.329529.468.515.315975.705.395.435239.184.725.535342.005.239.562314.005.239.633051.237.116.651136.255.8512.9表3为8周运动后大鼠右心室肌表达量下调≥5倍的蛋白质点的分子量(Mr)和等电点(pI)值 。
表3 8周运动后差异表达量下调≥5倍的蛋白质点
SSPMr/KDapI Folds34942.005.238.252124.567.879.711285.388.4311.321361.978.5614.650927.677.6016.135747.847.6316.746729.779.5431.256432.168.129.3图2为8周运动后表达量≥5倍蛋白质点的柱状图,柱状图中的横坐标依次代表对照组和运动 组的三张胶,纵坐标代表其表达量,从图中可以看出运动后其表达量的变化情况。
2.3 质谱鉴定结果 对8周运动后表达量差异在5倍以上的蛋白点用MALDI-TOF-TOF-MS进行检 测,获得的肽谱和肽段氨基酸结果在ncbi数据库检索,最终鉴定出5个蛋白质(表4)。35 3号点为心肌肌动蛋白α1 (Actin, alpha cardiac muscle 1),分子量41.99kDa,等电 点 5.23,运动后上调9.5倍。351号点为丙酮酸脱氢酶E1α1(Pyruvate dehydrogenase E1 a lp ha 1),分子量43.87kDa,等电点8.49,在运动后其表达上调5.3倍。295号点为一未知 蛋白 ,分子量29.46 kDa,等电点8.51,运动后表达上调5.3倍。159号点为膜联蛋白A6(Anne xi n A6),分子量75.70kDa,等电点5.39,运动后上调5.4倍。112号点为线粒体乌头酸水 合酶(Aconitate hydratase, mitochondrial),分子量85.38 KDa,等电点7.87,在运 动后下调11.3倍。
图2 8运动组与对照组蛋白质表达的差异图谱 表4 部分差异表达蛋白点质谱鉴定结果
SSPProtein NameM r(KDa)pIvariation353心肌肌动蛋白α141.995.23Up9.5倍351丙酮酸脱氢酶E1α143.878.49Up5.3倍159膜联蛋白A675.705.39Up5.4倍112线粒体乌头酸水合酶85.387.87 Down11.3倍295未知蛋白29.468.51Up5.3倍注:“Up”表示上调,“Down”表示下调。
图3为膜联蛋白A6(159号)的一级和二级质谱图,其中二级所取肽段峰值为2 210.731。
图3 159号点的质谱图(左)一级质谱图(右)二级质谱
3 分析与讨论
长期系统的运动训练可引起心脏的形态和功能发生适应性变化,而这种变化主要来自心 肌蛋白质的变化,右心室在维持肺灌注以及输送静脉血进行气体交换中起重要的作用,全面 了解右心室肌蛋白质组在运动应激状态下的表达情况,寻找在中小强度有氧运动状态下有意 义的右心室肌差异表达的蛋白质,对阐明运动引起心脏改变的机制有十分重要的意义。
3.1 心脏的形态学变化 本研究结果显示,运动组大鼠心脏重量 和心脏重量指数都增加。但 由于心脏绝对重量受到体重的影响,所以用心脏相对重量,即心脏重量指数作为判断肥大的 指标。且只有心脏重量指数的增高较为显着,具有统计学意义,这表明经过8周中小强度有 氧运动后心脏产生了形态学改变,从中可以推测,适宜负荷的长期运动使心肌肥厚,肥大后 的心肌收缩力增强,泵血功能也得到提高。
3.2 右心室肌蛋白质的变化 有研究表明,随着所处环境的改变 蛋白质将产生各种应答,包括蛋白质在细胞中的定位、构型改变、稳定性调节以及蛋白质结 合的各种物质的改变等[10,11]。在运动过程中的生理负荷刺激,可以引起机体内 蛋白质表达的改变,且这些改变与运动强度、运动方式、时间以及机体局部缺血、相对缺氧 等状况有关[12,13]。本研究发现,在8周中小强度有氧运动应激条件下,大鼠右室 肌蛋白质发生了显著的变化。对其变化的蛋白质点进行质谱鉴定,这些鉴定的蛋白质与心脏 收缩、代谢功能有关。
3.2.1 与能量代谢相关的蛋白心肌能量代谢底物以脂肪酸代谢为主,但在运动刺激条件下 ,心肌能量代谢途径会发生相应变化[14]。351号点是丙酮酸脱氢酶E1α1,分子量 为43.8 7 kDa,等电点8.49,属于丙酮酸脱氢酶系(PDHc)。PDHc通过催化主要来自葡萄糖和乳酸 的 丙酮酸盐的氧化脱羧作用在心脏中起着重要的能量动态平衡作用。丙酮酸脱氢酶复合物缺陷 是最常见的线粒体呼吸链能量代谢障碍性疾病之一,是原发性乳酸酸中毒的重要原因。在PDH c催化反应中,E1催化了其不可逆并且控制整个反应体系速率的第一步,即依赖焦磷酸硫胺 素(TPP)的丙酮酸脱羧反应。由此可见E1对整个PDHc反应活性的关键作用。E1ɑ亚单位缺陷 导致丙酮酸脱氢酶复合物活性下降,丙酮酸代谢障碍,引起乳酸酸中毒、神经肌肉损害等一系 列复杂的临床表现。
在本次实验中,丙酮酸脱氢酶E1α1在运动后表达水平上调,可能是机体通过8周运动后 适应此运动强度后出现的机体应激能力增强的表现,其结果表现为心脏能量供应得到改善, 以增强心脏的收缩性能,提高泵血能力。
线粒体乌头酸水合酶分子量为85.38kDa,等电点7.87,存在于线粒体,在三羧酸循环中 催化柠檬酸氧化成次异柠檬酸,对活性氧和氮分子相当易感,其活性易被其抑制。刘田的研 究结果显示[15],一次性力竭后心房肌中乌头酸水合酶的表达量上调了15.42倍, 这可能是 力竭运动使心肌缺血、缺氧,能量供应受到限制,机体通过增加乌头酸酶的活性来进行补偿 ,使能量供应得到加强。本研究显示,在8周运动训练后,乌头酸水合酶的表达量出现了下 调,这可能是长期运动氧化应激使活性氧产物增加而抑制了其表达,运动强度与运动时间对 乌头酸水合酶活性的调节机制产生了不同的影响。
3.2.2 与收缩相关的蛋白 353号点是心肌肌动蛋白α1,分子 量41.992 kDa,等电点5.23, 是重塑心肌中重要的收缩蛋白和细胞骨架蛋白,它既有收缩蛋白的功能参与肌肉的运动,又 是重要的骨架蛋白对细胞起支持作用。在心室重塑过程中α心肌肌动蛋白的活性发生变化并 且在心肌细胞中排列发生改变,其表达程度是决定心室重塑的重要因素之一[16]。
有研究表明,心肌梗死后心肌细胞凋亡、心肌细胞分裂增殖及肥厚在较长时间内可能同 时发生着并处于动态平衡之中。在本实验中表达量上调,分析原因其一可能是随着运动时间 的延长而造成心肌损伤,进而引起心肌细胞内收缩蛋白的降解,机体必然通过各种途径加强 收缩蛋白的合成来维持一定的运动能力及正常功能;其二是长期负荷训练使机体逐渐产生适 应,代谢水平提高,蛋白质合成速率加快。
膜联蛋白是一类结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族,在细胞中参与膜运转及膜表面 一系列依赖与钙调蛋白的活动,包括囊泡运输、吐泡作用中的膜联合、信号传导和钙离子通 道的形成、调控炎症反应等。膜联单白A6在内质网中钙离子的释放、摄取循环中起了调整作 用,在刺激应答系统起关键作用。在运动后其表达量上调,推测可能是心肌的一种分子补偿 机制,即通过增加钙循环效率来提高收缩功效。这表明心肌细胞与外界物质交往的能力增强 ,对调整钙离子参与心肌收缩能力得到加强,使心肌收缩更有力,泵血功能更强。
295号点是一分子量为29 kDa的未知蛋白,理论等电点为6.43,本实验大鼠右心室肌中它在 8周有氧运动后表达出现上调,其原因还未知,需要进一步的研究分析。
4 总 结
在中小强度有氧运动后,大鼠心脏发生形态学变化,右心室肌蛋白质组发生了明显的差 异性表达,经质谱分析,鉴定出了5种与心肌能量代谢和收缩有关的蛋白质,这些蛋白质对 研究运动对心肌的影响具有重要意义,为深入研究国民体质健康的运动干预,也为慢性心血 管疾病的运动康复提供实验依据。
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