摘要：在考察Ⅱ型ＺＴＣ１＋１天然澄清剂对巴西菇多糖提纯工艺影响的过程中，用单因素试验研究了提取原液稀释倍数、澄清剂用量、澄清剂絮凝温度对多糖损失率和蛋白脱除率的影响，进一步以多糖纯度为考察指标，利用响应面分析法优化各因素及其相互作用后获得的最佳工艺条件为提取原液稀释倍数７．２0，澄清剂用量７．４４％，澄清剂絮凝温度５７．２３℃，此时，巴西菇多糖纯度为６２．７８％。
关键词：巴西菇；多糖；ＩＩ型ＺＴＣ1＋1天然澄清剂；脱蛋白；提纯
中图分类号：Ｓ６４６．１＋１；Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）06－1250-05
The Effect of Ⅱ Type ZTC1+1 Natural Clarifying Agents Used for Agaricus brasiliensis Polysaccharide Purification
ＳＨＩ Ｄｅ－ｆａｎｇ，ＧＡＯ Ｈｏｎｇ，ＺＨＯＵ Ｍｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｄｅ，ＧＵＡＮ Ｊｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｘｕｅ－ｌｉｎｇ，ＨＥ Ｊｉａｎ－ｊｕｎ
（ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ－Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｕｂｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ／， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｂｙ Ⅱ type ＺＴＣ1＋１ ｎａｔｕｒａｌ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ， ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ， ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ⅱ type ＺＴＣ１＋１ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｌｏｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｗａｓ ７．２0， ｔｈｅ ａｄｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ （ｉ．ｅ． Ｂ ａｎｄ Ａ） ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ７．４４％， ｔｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ５７．２３℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗａｓ ６２．７８％。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； ＩＩ type ＺＴＣ1＋1 ｎａｔｕｒａｌ ｃｌａｒｉｆｉｅｒ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
巴西菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又名姬松茸，是一种重要的药食兼用菌。其子实体肉质鲜嫩、香气浓郁、美味可口，含有丰富的蛋白质、核酸、多糖类、甾醇、维生素等多种活性物质，营养价值极高。近年来研究发现，巴西菇具有抑制肿瘤细胞生长，降低血糖、胆固醇含量，改善糖尿病、动脉硬化的作用。其中的多糖类物质经试验证明具有显著的抗肿瘤活性，在已知具有抗癌活性的真菌中居首位［１，２］。目前已报道的提纯巴西菇多糖的方法有热水浸提法、酶提法、酸提法、超滤、层析法等，这些方法在巴西菇多糖的提取效率和粗多糖纯化应用方面存在一些问题，有的方法非常适合微量分离纯化，有的方法所需试剂成本高且处理量有限，有的方法需要的设备投资较大且能耗较高，特别对于溶剂的不安全性和回收利用困难等问题未得到解决，多数只适合在实验室进行基础性的研究，不适合大规模的工业生产应用。
吸附澄清法是在提取液中加入一种吸附澄清剂，通过吸附的方式除去溶液中的粗颗粒，达到提纯目的的一项新技术。Ⅱ型ＺＴＣ１＋１天然澄清剂属新型药用辅料，是一种天然高分子化合物，安全无毒，该澄清剂由两部分组成，一组分起主絮凝作用，另一组分起辅助絮凝作用，可除去提取液中的淀粉、鞣质、黏液质、蛋白质等大分子杂质而对多糖影响较小。本研究从利于工业化生产的角度出发，对巴西菇多糖的脱蛋白方法进行了比较，并且对巴西菇多糖纯化制备工艺进行优化，以期用较低的成本得到较高纯度的巴西菇多糖。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１巴西菇由湖北咸宁市黄道核农科技有限公司提供。清洗干净后烘干，粉碎过６０目筛备用。
１．１．２试剂葡萄糖对照品，溶液配制时要将葡萄糖在１０５℃下干燥至恒重，然后称量定容，水为去离子水；苯酚、浓硫酸、乙醇均为分析纯；考马斯亮蓝Ｇ－２５０、牛血清白蛋白（ＢＳＡ），上海化学试剂公司；Ⅱ型ＺＴＣ1＋1澄清剂，天津正天成澄清技术有限公司。
１．１．３仪器电热恒温水浴锅（ＤＺＫＷ－Ｄ－２型，北京市永光明医疗仪器厂）；紫外可见分光光度计（Ｔ６新世纪型，北京普析通用仪器有限公司）；旋转蒸发仪（ＲＥ－５２型，上海亚荣生化仪器厂）；循环水式真空泵［ＳＨＺ－Ｄ（Ш）型，巩义市予华仪器有限责任公司］；植物粉碎机（ＬＧ－５００Ａ型，瑞安百信药机械厂）；低速自动平衡离心机（ＤＴ５－４Ｂ型，北京时代北利离心机有限公司）；电热鼓风干燥箱（ＣＳ１０１－１Ｅ型，重庆四达试验设备有限公司）；电子天平（ＦＡ１１０４Ｎ型、ＹＰ６０１Ｎ型，上海精密仪器有限公司）。
１．２方法
１．２．１多糖提取原液的制备取３０ ｇ烘干的巴西菇粉于６００ ｍＬ去离子水中９０℃浸提３ ｈ，浸提２次，过滤，合并，浓缩提取原液至多糖提取液体积与原料质量的液料比为１∶１（Ｖ/Ｗ，ｍＬ∶ｇ，下同），备用。
１．２．２脱蛋白试验
１）Ｓｅｖａｇ法脱蛋白。稀释粗多糖提取原液５倍，分为６份，每份５０ ｍＬ，进行脱蛋白处理。设脱蛋白１、２、３、４、５、６次６个处理，每次加Ｖ氯仿∶Ｖ正丁醇＝４∶１的混合液１０ ｍＬ，磁力搅拌３０～４０ ｍｉｎ后，离心１０ ｍｉｎ（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ），将水相与氯仿相分开，倾出上清液。
２）ＺＴＣ法脱蛋白单因素试验［３］。Ⅱ型ＺＴＣ1＋1天然澄清剂的配制：ａ组分、ｂ组分溶液分别按要求调配成１％的黏胶液。①提取液浓缩浓度的考察试验。取上述粗多糖提取原液３份，按试验要求将提取原液分别稀释５、７、９倍，加入８％ ｂ澄清剂，８０℃保温２ ｈ，每３０ ｍｉｎ搅拌１次；再加入４％ ａ澄清剂保温１ ｈ，每３０ ｍｉｎ搅拌１次，静置５ ｈ，离心１０ ｍｉｎ
（４ ０００ ｒ/ｍｉｎ），倾出上清液，试验设２次重复；②澄清剂用量的考察试验。将提取原液分别稀释５倍，分成３份，按试验要求设定澄清剂用量体积分数分别为２％ ｂ+１％ ａ、４％ ｂ+２％ ａ、８％ ｂ+４％ ａ进行试验，温度和搅拌时间不变，静置５ ｈ，离心１０ ｍｉｎ
（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ），倾出上清液，试验设２次重复；③澄清剂絮凝温度的考察试验。将提取原液分别稀释至５倍，分成３份，按试验要求设定在不同絮凝温度５０、６５、８０℃进行试验，加入８％ ｂ澄清剂，保温２ ｈ，每３０ ｍｉｎ搅拌１次；再加入４％ ａ澄清剂保温１ ｈ，每３０ ｍｉｎ搅拌１次，静置５ ｈ，离心１０ ｍｉｎ（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ），倾出上清液，试验设２次重复。将上述上清液定容，测定并记录脱蛋白前后的多糖和蛋白质含量。
３）多糖含量测定。上清液加入４倍体积的无水乙醇（乙醇终体积分数为８０％），于４℃冰箱中静置过夜。取出再离心，弃上清液，收集絮状沉淀，无水乙醇洗涤２次后于５０℃下真空干燥至恒重得到粗多糖，称量后定容。苯酚－硫酸法测多糖含量［４］。
多糖纯度＝粗多糖中多糖质量／粗多糖质量×１００％
多糖损失率＝（C１－C２）／C１×１００％
式中，C１为脱蛋白处理前多糖含量；C２为脱蛋白处理后多糖含量。
４）蛋白质含量测定。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法［５］。
蛋白脱除率＝（Ｎ１－Ｎ２）／Ｎ１×１００％
式中，Ｎ１为脱蛋白处理前蛋白质含量；Ｎ２为脱蛋白处理后蛋白质含量。
１．２．３Ⅱ型ＺＴＣ1＋1天然澄清剂提纯巴西菇多糖工艺在前期试验的基础上，以影响巴西菇提取液脱蛋白效果的３个关键因素，即提取原液稀释倍数、澄清剂用量及澄清剂絮凝温度为考察因子，同时以多糖纯度为评价指标，采用３因素３水平Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计，对脱蛋白条件进行优化。表１显示了脱蛋白试验条件的因素与水平。
２结果与分析
２．１单因素试验
２．１．１不同提取原液稀释倍数对多糖损失率和蛋白脱除率的影响由图１可知，随着提取原液稀释倍数的提高，多糖损失率增加，同时脱蛋白的效果随之提高。每次除去的蛋白质变性胶状物中，难免会溶有少量多糖，而且与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时也会沉淀下来，造成多糖损失。提取原液稀释倍数为５倍时，脱蛋白效果较好。
２．１．２不同澄清剂用量对多糖损失率和蛋白脱除率的影响随着澄清剂用量的提高，蛋白脱除率也有提高，同时降低了多糖损失。由图２可见，采用澄清剂８％ ｂ组分＋４％ ａ组分的脱蛋白效果较好。
２．１．３不同澄清剂絮凝温度对多糖损失率和蛋白脱除率的影响由图３可知，在不同的澄清剂絮凝温度下进行试验，对蛋白脱除率和多糖损失率结果进行了综合比较，当反应温度为６５℃，在获得较大蛋白脱除率的同时，相对降低了多糖的损失，脱蛋白效果较好。
在筛选出的提取原液稀释倍数为５倍、澄清剂用量为８％ ｂ组分＋４％ ａ组分、６５℃保温条件下进行验证试验，测定巴西菇多糖损失率为５．７８％，蛋白脱除率为５３．２５％。
２．２不同脱蛋白方法的比较
对两种脱蛋白方法的蛋白脱除率和多糖损失率结果进行了综合比较（表２），Ｓｅｖａｇ法进行了６次脱蛋白处理后，蛋白脱除率为５７．３２％，随着脱蛋白次数的增加，糖液中多糖的损失也在增加，６次脱蛋白处理后糖液中多糖损失率高达３６．５７％。而Ⅱ型ＺＴＣ1＋1法一次性处理所得蛋白脱除率为５３．２５％，几乎接近了Ｓｅｖａｇ法的６次处理结果。
Ｓｅｖａｇ法脱蛋白使用的试剂是氯仿和正丁醇，而氯仿是有毒物质，容易造成多糖活性下降和溶剂残留。另外由于每次脱蛋白处理都会造成一定的糖液损失，所以经过多次脱蛋白处理后多糖的损失较大。ＺＴＣ法的运用明显降低了多糖的损失，相对于Ｓｅｖａｇ法消耗大量氯仿和正丁醇试剂，既增加成本又具有毒性的缺点，ＺＴＣ法脱蛋白效率较高。
２．３Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验
２．３．１Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验响应面分析根据表３所得试验数据分析，得出回归方程的复相关系数为０．９６３ ９，校正相关系数为０．９１７ ５，说明回归方程的相关性较好；模型的Ｐ＜０．０1（表４），表明回归方程的Ｆ检验极显著， 所拟合的二次回归方程合适。由响应面回归分析拟合绘制响应面图（图４～图６）。
利用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ软件，将多糖纯度试验数据进行多元回归拟合，获得多糖纯度对编码自变量提取原液稀释倍数、澄清剂用量及澄清剂絮凝温度的二次多项回归方程：Ｙ＝５８．８２＋２．８６Ａ＋１１．３５Ｂ－５．７0Ｃ－１１．３５Ａ２－１１．８５Ｂ２－５．１７Ｃ２＋１．３７ＡＢ＋２．３４ＡＣ＋０．２３ＢＣ
２．３．２提取原液稀释倍数与澄清剂用量对多糖纯度的交互影响图４显示了澄清剂絮凝温度在中心值条件下，提取原液稀释倍数与澄清剂用量对多糖纯度的影响有交互作用。在澄清剂用量低于７％时，多糖纯度随提取原液稀释倍数有所起伏但变化不大。当澄清剂用量处于７％～８％时，多糖纯度表现出对提取原液稀释倍数的依赖关系，在稀释倍数小于６．５时，多糖纯度随稀释倍数的增加而增加，而在稀释倍数大于８时，多糖纯度随稀释倍数的增加反而减少。由此可知，保持提取原液稀释倍数在中等偏上水平能获得较高的多糖纯度。
２．３．３提取原液稀释倍数与澄清剂絮凝温度对多糖纯度的交互影响图５显示了澄清剂用量在中心值条件下，提取原液稀释倍数与澄清剂絮凝温度对多糖纯度的交互影响。当稀释倍数小于７时，澄清剂絮凝温度在５０～６５℃，多糖纯度表现出对稀释倍数呈线性上升趋势。当澄清剂絮凝温度在６５～８０℃，获得的多糖纯度值随着稀释倍数的升高而缓慢提高。稀释倍数大于８时，澄清剂絮凝温度在低水平范围内，多糖纯度表现出对稀释倍数呈线性下降趋势。当澄清剂絮凝温度在高水平范围内时，随着稀释倍数的升高而呈急速下降趋势。由此可知，澄清剂絮凝温度保持低水平能获得较高的多糖纯度。
２．３．４澄清剂用量与澄清剂絮凝温度对多糖纯度的交互影响图６显示了提取原液稀释倍数在中心值条件下，澄清剂用量与澄清剂絮凝温度对多糖纯度的交互影响。当澄清剂絮凝温度在低水平范围内时，多糖纯度随着澄清剂用量的增加几乎呈直线上升趋势。由图６可知，澄清剂用量保持较高水平能获得较高的多糖纯度。
通过回归模型和响应面分析来预测巴西菇多糖纯度高于６２％的提取工艺参数为提取原液稀释倍数６．６０～７．２６，澄清剂用量７．１0％～７．６２％，澄清剂絮凝温度５２．２５～６１．２５℃。
２．３．５验证试验对回归模型进行规范性分析，寻求最大值的稳定点及对应的因素与水平，结合图４～图６给出的回归方程的三维响应面图以及等高线图可知，回归模型存在稳定点，稳定点即最大值。根据回归方程求稳定点的值，对回归方程分别求一阶偏导等于零，整理得：
２．８６－２２．７0Ａ＋１．３７Ｂ＋２．３４Ｃ＝０
１１．３５－２３．７0Ｂ＋１．３７Ａ＋０．２３Ｃ＝０
－５．７０－１０．３４Ｃ＋２．３４Ａ＋０．２３Ｂ＝０
解方程组得到模型的极值点为：Ａ＝０．１０１ ６，Ｂ＝０．４７９ ８，Ｃ＝－０．５１７ ６，代入回归方程可以确定多糖纯度的最大值为６３．１６％，进行编码代换，得到各因素最佳的真实值，提取原液稀释倍数为７．２0，澄清剂用量为７．４４％，澄清剂絮凝温度为５７．２３℃。
为检验结果的可靠性，采取响应面分析法得到的最佳条件进行３次平行试验，结果得出，ＺＴＣ澄清剂法得到的巴西菇多糖纯度为６２．７８％。与理论值基本吻合。因此，利用响应面分析的提纯条件真实可靠，具有实际意义。
３结论
ＺＴＣ法脱蛋白和传统的Ｓｅｖａｇ法比较，具有高效、低毒、成本低、操作方便等优点；单因素试验筛选出ＺＴＣ法脱蛋白试验的最优条件：提取原液稀释倍数为５，澄清剂用量为８％ ｂ组分＋４％ ａ组分，６５℃下保温处理，此时的多糖损失率为５．７８％，蛋白质脱除率为５３．２５％；以巴西菇多糖纯度为考察指标，采用响应面分析法优化获得Ⅱ型ＺＴＣ1＋1天然澄清剂提纯制备巴西菇多糖最优工艺条件：提取原液稀释倍数为７．２0，澄清剂用量为７．４４％，澄清剂絮凝温度为５７．２３℃，验证得到的巴西菇多糖纯度为６２．７８％，与预期值相符。
参考文献：
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