艾滋病毒即人类免疫缺陷病毒，可严重破坏人体的免疫系统，诱发严重感染及癌症，发展到最后，将会导致获得性免疫缺陷综合症。到2010年底，联合国艾滋病规划署估计全世界范围内HIV感染者约3400万，2010年内大约有260万HIV新感染者，并有180万人死于AIDS[1]。因此，HIV检测对于艾滋病的筛查、诊断、病程监控、指导治疗方案具有重要的意义。本文将简述近年来HIV实验室检测方法的研究进展，这些检测方法对于控制艾滋病毒的流行，艾滋病毒感染的诊断、筛查、监测显得尤为重要。
1HIV感染期间的标志物及其意义
在HIV感染后依次能检测到病毒RNA，p24抗原，最后是抗体[2]。在感染HIV后2w内（10~12d）,血液中病毒RNA数量呈指数级递增。当HIV感染者发展为AIDS后，机体免疫已不能抑制HIV的复制，病毒RNA数量再次呈指数级上升。因此病毒RNA水平是判断病毒复制情况以及监控病情发展的重要指标。HIV感染后的11~13d，血液中就可以检测到p24抗原。p24可作为病毒复制的间接指标。p24水平随HIV的复制而增加，并在感染后45d内保持在较高水平，但由于其检测方法较RNA检测方法灵敏度低，因此p24检出时间比RNA晚[3]。在感染HIV后的很长一段时间内，不能在宿主体内检测到HIV特异性抗体，称为“窗口期”。“窗口期”的长短由病毒的致病性和宿主的免疫能力有关。在窗口期，可以通过病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴细胞水平来确定HIV感染。在HIV感染的整个过程中，CD4淋巴细胞水平逐渐下降，当其水平降低至200个细胞/毫升血液时，就会导致严重的免疫缺陷，HIV感染者将发展为AIDS[4]。在大部分HIV感染者体内最先出现的抗体类型是IgM。IgM一般在HIV感染后第3w出现，并在第4~5w达到峰值。然而由于个体差异及方法学灵敏度等原因，IgM并不能在每个HIV感染者血液中检出[5]。HIV特异性IgG通常在感染后3~4w出现，随后IgG滴度迅速上升，直至10~12w左右开始下降。IgG滴度的降低是由IgG3亚型的降低导致的，随后IgG滴度再次迅速增加[6]。尽管有个体可能6个月后才出现HIV抗体，但大多数HIV感染者血液中2~3个月都能检测到HIV抗体[7]。HIV抗体的出现抑制了HIV病毒的复制，并形成p24特异性抗体/p24复合体，降低了血液中的RNA及p24水平。最终，HIV感染者发展为AIDS，免疫系统崩溃，病毒再次大量复制，血液中的RNA、p24水平再次升高。因此，通过检测病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴细胞以及HIV抗体在血液中的含量，可以诊断HIV感染及监控病情的发展。
2HIV实验室检测方法
2.1 HIV抗体检测目前，检测HIV抗体的方法多达100余种，总体来说可以分为筛查试验和确认实验。只有拥有较高灵敏度，即较低假阴性率的检测方法才能用于筛查试验。相反，确认实验对检测方法的要求是高特异性，即检测结果具有较低的假阳性率。一般情况下，筛查实验筛查出阳性的标本必须要经过确认实验再次检测，以达到确认检测结果的目的
2.1.1 HIV抗体筛查试验目前，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用的筛查试验。1985年，美国FDA批准使用第一代ELISA检测试剂筛查HIV，可以在感染后40d左右筛查出HIV特异性抗体，第一代试剂主要以病毒的裂解产物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，采用间接法筛查HIV。由于常混杂有细胞培养中的蛋白成分或其他杂蛋白而出现较多的假阳性反应。1990年，第二代ELISA试剂将重组或合成的多肽抗原（包括M,N,O）包被在反应板中，实现了HIV-I和HIV-II同时检测，并将检出时间缩短为33~35d。由基因重组获得的抗原具有良好的同源性，产品的灵敏度与特异度较第一代试剂有了很大的提高[8]。1992年，第三代ELISA试剂检测方法与前两代不同，采用双抗原夹心法检测抗体。由于其可以检测所有抗体亚型(包括IgG,IgM,IgA)，因此具有更高的灵敏度与特异性。第三代ELISA试剂将HIV抗体检测的“窗口期”缩短为22天左右。第四代ELISA试剂在第三代的基础上进一步增加了p24抗原的检测，可同时检测HIV抗体及p24抗原，进一步缩短了“窗口期”，减少了急性感染窗口期漏检。但由于“第二窗口期”的存在，也使得第四代试剂检测的敏感性受到影响[9]。目前，在我国第三代试剂应用最为广泛，第四代试剂还没有普及。第三代和第四代试剂的特异性大约在99.5%~99.9%，这就意味着可能会有一定假阳性的出现。假阳性结果一般是由于非特异性抗体结合HIV抗原导致的[10]。某些病毒感染的患者在进行HIV筛查时可能出现假阳性的结果。此外，患有自身免疫性疾病、恶性淋巴瘤的患者也可能会出现假阳性的结果[11]。鉴于筛查实验可能会出现假阳性的结果，只有进行确认试验后才能得出HIV阳性的结论。
2.1.2 HIV抗体确认试验目前，HIV确认实验主要有免疫印迹实验（western blot,WB）和线性免疫分析法（line immune assays,LIA）两种，其中前者最为常用。WB通过SDS-PAGE电泳将HIV全病毒抗原按照分子量的大小分离开来，然后再从凝胶转移到固相支持物硝酸纤维素膜上。如HIV-1，分离开来的病毒抗原可分为三带：①env带，指gp160、gp120、gp41；②gag带，指p55、p24/25、p17；③pol带，指p68、p52、p40、p34。经稀释过的待检血清样品直接加到硝酸纤维素膜上，若血清中含有HIV抗体，则会与膜上的抗原带结合。然后加入酶标的第二抗体和底物，根据条带的显色情况来判定结果。根据国际公认的美国CDC判断标准，出现以下两种情况就可判断为阳性：①至少有二条env带（gp160/gp120和gp41）；②至少有一条env带和p24带同时出现。目前，HIV商品化试剂盒同时含有HIV-1与HIV-2抗原，可实现两种亚型的同时检测。与ELISA方法相比较，WB具有更高的敏感度和特异性，然而由于病毒在浓缩和纯化后仍可能存在培养用的宿主细胞，出现非特异性反应，大多数出现在中分子量区域，产生不确定结果。线性免疫分析法原理与蛋白质印迹法相似，但与蛋白质印迹法相比较，线性免疫分析法价格较为昂贵，应用受到限制。
2.2 HIV快速检测试验HIV快速检测试验主要包括免疫斑点试验、免疫层析试验以及凝集试验等。HIV快速检测试验可检测血浆、末梢血、尿液、唾液等标本，并在30min钟内完成检测，因此在一些紧急筛查时，如急诊手术、穿刺等，显得尤为重要。然而，有调查表明HIV快速检测试验的敏感度仅为90.2%，其敏感度与ELISA和WB相比要低得多，因此将会导致漏检情况的出现[12]。此外，HIV快速检测试验的特异性也较低。据Gray的一份研究表明，94.1%快速检验弱阳性的标本经确认实验复检后得出阴性或不确定的结论[13]。鉴于快速检验敏感度和特异性较低，专家建议快速检验应与ELISA或WB联合应用[14]。HIV快速检测试验操作简便，成本较低，要求的标本量较小，适合于基层医院HIV的快速筛查，尤其对发展中国家或偏远地区具有重要的意义[15]。
2.3 HIV核酸检测随着技术的发展，核酸检测的灵敏度已经得到质的飞跃，甚至达到超灵敏，使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。目前，HIV核酸检测方法主要包括聚合酶链反应,转录介导扩增,支链DNA，连接酶链反应以及实时荧光定量PCR技术等。这些方法在许惠敏等的论述中已有详细描述，在此不再赘述[16]。HIV病毒RNA检测被广泛应用于检测病毒抗转录治疗后的监测，病毒载量与HIV病毒RNA成平行关系。随着第三代及第四代ELISA试剂的应用，HIV血液传播被有效的控制，然而如果进一步降低“窗口期”的传播，就需要核酸检测进行支持。HIV病毒的易变性也严重影响着核酸检测的灵敏度。当存在HIV变种的情况时，引物和探针都具有特异性不能发挥扩增的作用，因此HIV核酸检测应用受到限制。
2.4流式细胞技术流式细胞仪是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强有力的应用工具。淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群，在免疫应答过程中，淋巴细胞发育成功能不同的亚群，各亚群的数量和功能产生异常时，就会导致机体免疫紊乱并产生病理变化。HIV病毒感染整个过程中，总CD4淋巴细胞水平随感染的发展而逐渐降低，当其在血液中下降到200个/ml时，就会导致严重的免疫功能障碍，即发展为AIDS。通过流式细胞仪对血液中的T细胞亚群分类并计数，可以发现HIV感染者血液中的T淋巴细胞总数及百分数、CD4淋巴细胞及百分数、CD4淋巴细胞与CD8淋巴细胞比值均降低，从而提示HIV感染的可能性。
在过去的20多年里，随着生物技术的不断进步，HIV检测方法也在不断的提高，HIV感染的窗口期也随之缩短。随着生物技术的进一步发展以及HIV感染机制的明确，新的检测技术将会出现，为HIV感染的筛查、诊断、监测及控制提供强有力的支持。
参考文献：
[1]Joint United Nations Program on HIV/AIDS[R].World AIDS Day Report-2011.Geneva:UNAIDS.
［2］Weber B.Screening of HIV infection:role of molecular and immunological assays[J].Expert Rev Mol Diagn, 2006,3:(6):399-411.
［3］Fiebig eW,Wright DJ,rawal BD,et al.Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors:implications for diagnosis and staging of primary HIV infection[J].AIDS ,2003,17(13):1871-1879.
［4］Fanales-Belasio E,Raimondo M,Suliqoi B,et al.HIV virology and pathogenetic mechanisms of infection:a brief overview[J].Ann Ist Super Sanita,2010,46(1):5-14.
［5］邱仁宗,翟晓梅,贾平,等.关于建立经医疗输血或使用血液制品感染艾滋病病毒保险和补偿机制的意见[J].中国医学伦理学,2013,26(1):8-13.
［6］Murphy J,Parry V.assays for the detection of recent infections with human immunodeficiency virus type 1[J].Eurosurveillance ,2008,13(36):537-545.
［7］吴焱,徐克沂,王玉光,等.急性期/早期HIV-1感染的临床研究进展[J].中国艾滋病性病,2011,17(3):372-375.
［8］Buttòs,S,Suliqoi B,Fanales-Belasio E,et al.Laboratory diagnostics for HIV infection[J].Ann Ist Super Sanita,2010,46(1):24-33.
［9］Meier t,Knoll e,Henkes M,et al.evidence for a diagnostic window in fourth generation assays in HIV-1[J].J Clin Virol, 2001,23(1):113-116.
［10］谭立明.ELISA法检测的影响因素及其对策[J].实验与检验医学,2013,31(4):300-305.
［11］郭潇潇,韩冰,周道斌,等.自身免疫性疾病转为恶性淋巴瘤12例临床分析[J].北京医学,2008,30(3):129-132.
［12］Black V,von Mollendorf ce,Moyes Ja,et al.Poor sensitivity of field rapid HIV testing:implicationsfor mother-to-child transmission programme[J].BJOG, 2009,116(13):1805-1808.
［13］张晓红,张倩,周学红,等.雅培化学发光法在HIV筛查试验中假阳性分析[J].标记免疫分析与临床,2013,20(1):43-46.
［14］anzala O,Sanders eJ,Kamali a,et al.Sensitivity and specificity of HIV rapid tests used for research and voluntary counselling and testing[J].East Afr Med J,2008,85(10):500-504.
［15］World Health Organization.Rapid HIV tests:guidelines for use in HIV testing and counselling services in resource constrained settings. Geneva:WHO;2004.Available from:www.emro.who.int/aiecf/web28.pdf.
［16］许惠敏,毛爱红.HIV检测技术的研究进展[J].卫生职业教育,2008,26(20):149-151.
编辑/王敏
推荐访问： 研究进展 检测方法 实验室 HIV
