摘要主要从CRISPR/Cas9系统的基本原理、应用及其存在的问题等方面进行了综述，并对该技术如何应用于烟草遗传育种以及分子改良研究进行了展望。
关键词CRISPR/Cas9；基因组；定点编辑；烟草
中图分类号S503.2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）22-118-04
AbstractWe reviewed the fundamental principle， application and existing problems of CRISPR/Cas9. And the application of CRISPR/Cas9 in tobacco genetic breeding and molecular modified research were forecasted.
Key wordsCRISPR/Cas9； Genome； Target editing； Tobacco
随着分子生物学的进步及大量生物基因组测序工作的完成，人类对生物特定基因的DNA序列进行定点编辑得以实现。从最初应用于酵母细胞DNA改造的同源重组技术，基因编辑经历了锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases， ZFNs）和TALE核酸酶（Transcription activator like effector nucleases， TALENs）2个重要的发展时期，直到CRISPR/Cas9技术被大量报道，基因编辑技术迎来了新的发展契机。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9是一种新型的基因组定点编辑工具，该技术已发展成为继锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）及TALE核酸酶（Transcription Activator-like Effector Nucleases，TALENs）后对基因定点高效编辑的首选技术。
CRISPR/Cas系统最早被发现于细菌中，属于细菌在进化过程中演化出的一种天然免疫方式。研究者已成功利用Type II型CRISPR/Cas9对多种生物的基因组进行了定点编辑。CRISPR/Cas9系统是一种高效、快速、简单的基因组定点编辑新技术，该技术利用细菌人工核酸酶在DNA靶位点产生DNA双链断裂，从而实现对基因组的定点编辑。CRISPR/Cas9技术目前已在多种模式生物（干细胞、斑马鱼、爪哇蟾、酵母、大肠杆菌、水稻及烟草等）中被成功应用，相信未来该技术会成为每个生物学实验室必备的基因定点编辑工具。对于农业研究，该技术应用于动植物新品种的培育会极大地提高创制动植物优异新种质的效率[1]。
烟草育种是综合运用植物遗传学、育种学以及其他相关学科的理论和技术，对不同烟草栽培类型的遗传组成进行有效改良和创新，培育和创造烟草优良新品种，不断满足烟草生产发展的需求[2]。烟草是我国最重要的经济作物，现行品种的抗病、产量、烘烤品质等性状均存在诸多问题。因此，培育新型烟草品种及创制烟草种质资源对国民经济增长具有重要意义[3]。笔者CRISPR/Cas9系统的基本原理应用及存在的问题进行了综述，并对该技术如何应用于烟草遗传育种以及分子改良研究进行了展望。
1CRISPR/Cas9系统基本原理
1.1CRISPR/Cas9 作用原理
CRISPR/Cas9来自细菌TypeⅡ型免疫系统，该蛋白为多结构复合体，主要包含RuvC-like 结构域及位于中间的HNH结构域，HNH与sgRNA（single-strand guide RNA）结合形成Cas9-sgRNA复合体[4-5]。复合体中的sgRNA与靶向DNA特异性配对，配对完成后Cas9会对靶向DNA原型间隔序列毗邻基序（Protospacer adjacent motif， PAM）上游3 nt处的碱基进行剪切。Cas9蛋白中RuvC与HNH结构域都具有核酸内切酶活性，HNH识别PAM序列后对与sgRNA互补配对的DNA单链进行切割并产生缺口（nick），RuvC则剪切另一条单链[6]。Sternberg等[7]研究发现，Cas9携带sgRNA的复合体会在全基因组上快速地搜寻PAM序列，PAM序列作为触发器催化Cas9行使剪切功能，即便sgRNA是与非目标区段完全配对，若无PAM的存在Cas9蛋白直接忽略配对。如果基因组PAM序列呈现高密度串联重复，Cas9蛋白可能会错误识别靶位点。由于Cas9剪切DNA双链产生缺口（nick），造成基因组碱基序列缺失、替换、插入等多种损伤，真核生物会通过非同源性末端重组（Non-homologous End Joining，NHEJ）修复机制，将缺口两端的DNA序列直接相连，补平缺口。该修复机制完成后，靶向DNA的序列会发生改变，即通过sgRNA引导Cas9蛋白实现对基因组序列的定点编辑（图1）。化脓性链球菌Streptococcus pyogenes Cas9蛋白是目前使用最多的CRISPR核酸酶，Jinek等[8]利用单粒子显微镜重塑技术，结果发现，SpCas9晶体中的核酸酶部分（RuvC与HNH结构域）在剪切DNA双链时，与螺旋蜷曲结构域之间产生一定的缝隙，该缝隙使Cas9蛋白能够适应不同sgRNA的引导。其他类型的Cas蛋白同样具有较高的应用价值，Luo等[9]用大肠杆菌TypeI-E型CRISPR/Cas系统抑制基因表达，通过删除cas3基因，该免疫系统转变为可编程的基因调节器。该系统靶向启动子与编码序列都会导致转录抑制，由此可见，CRISPR家族不同类型的蛋白具有许多特殊的研究用途。
2CRISPR/Cas9的特点、问题及应用
2.1CRISPR/Cas9特点
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