摘要 从沼气发酵体系中分离的产木聚糖酶菌株，经16SrDNA测序分析，生理生化鉴定生物学特性表明：YNUCC0237（S6-1）菌株是肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），B5-1菌株是摩氏摩根菌（Morganella morganii），B5-3菌株为Enterococcus sp.，B1-1h和B1-2h菌株均为Pseudomonas sp.。前3株菌是兼性厌氧菌，后2株不能在固体培养基表面好氧生长。酶产生主要在厌氧条件下，摇瓶条件下不产或产酶相对很低。S6-1菌株产酶活力可达40IU，酶与底物反应的最适pH值6.5，温度50℃。S6-1菌株具有广泛全面的食性，说明该属克雷伯氏菌具有对基质利用的多样性和代谢多功能性，是生物质转化利用中具有较大潜力的一类微生物资源。
关键词 木聚糖酶；兼性厌氧菌；克雷伯氏菌；摩氏摩根菌；肠球菌；生物学特性
从垃圾中或近似垃圾的林业、农业、养殖及其加工等过程的残余物中获得大量有用的食物、能源燃料和化学品是人类的梦想和研究重点之一[1]。半纤维素是一类取之不尽的可再生资源，生物降解开发利用作为碳源用于各种发酵生产等多方面。已知植物细胞壁构架物质纤维主要衬质为半纤维素和果胶质等。半纤维素定义来源于1891年舒尔茨（Schulze）在研究植物组织分离出一类多糖，认为是纤维素的半成品或纤维素的前体分子，所以把它称作半纤维素，没有化学通式，而是根据化学组成中的主要单糖成分区分为：①甘露聚糖类半纤维素，主链由甘露糖以β~1,4糖苷键连接而成；②木聚糖类半纤维素，主链是由以β~1,4糖苷键连成的木糖链状分子，大约每10个木糖残基有7个被乙酰化；③半乳聚糖类半纤维素，主要代表是阿拉伯～半乳聚糖；④木糖～葡聚糖类半纤维素，有象纤维素的β~l,4链的葡聚糖骨架，但在糖苷键C-6位上接有很多木糖侧链。半纤维素的种类很多，是不足200个糖基高度分枝的杂多聚糖，一般是非结晶状杂多糖，结构复杂，与物种差异有关。半纤维素被彻底水解后的糖残基，包括戊糖（D-本糖、L-阿拉伯糖）、己糖（D-半乳糖、L-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖）和糖醛酸（D-葡萄糖醛酸），以及这些残基被乙酰化或甲基化的修饰[2]。
利用半纤维素首要问题是水解为单糖，对于生物降解则需要高活性的酶，那么其对应被研究的微生物应有较广泛的食谱特征，才能有效地降解和利用半纤维素中复杂的戊糖和己糖及其修饰衍生物成分。对半纤维素酶和它们的基因研究已经进行了很多工作，半纤维素酶包括：木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、木聚糖乙酰酯酶。木聚糖酶是当前研究最多，应用较为广泛的半纤维素酶[1-3]。本文研究了从沼气发酵体系中分离筛选到的一类具有在厌氧条件下产木聚糖酶，而在好氧条件下不产木聚糖酶或产生酶活极少的兼性菌，这不仅能揭示厌氧发酵中半纤维素被降解利用，而且对于利用半纤维素降解物生产燃料乙醇[4]或改进发酵工艺技术方面将具有重要意义。
1材料和方法
1.1主要仪器
PCR仪（Biometra, TGRADIENT），721-100型分光光度计（上海第三分析仪器厂），pHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂），TGL-16G高速离心机（江苏金坛市中大仪器厂）。
1.2主要药品试剂
桦木木聚糖（Birchwood xylan）和矿物油（Mineral oil）购自Sigma公司。Tryptone and Yeast extract 购自OXOID LTD。用于菌种生理生化鉴定的微量鉴定管（浙江杭州天和微生物试剂有限公司），所缺或鉴定中现象不明显的自行配制补充参考。细菌基因组DNA提取试剂盒（上海华舜生物有限公司）。
1.3产木聚糖酶兼性厌氧菌的富集、分离和选育
玉米芯粗粉100g，蛋白胨（国产）20g，硬脂酸5g或粗制品牛油10g，加自来水1000mL，调pH值至8，添加10mL微量矿物溶液[5,6]，接入沼气发酵活性底泥10g左右，用Mineral oil密封（高2～3cm）。30℃保温富集培养不少于30d。采用Mineral oil 密封-平板稀释法分离长于培养基内的单菌落[5]。所得菌落直接挑入预先制备的产酶培养基[5,6]中，一部分在30℃下，另一部分是在50℃下，静置培养15d，离心并除去Mineral oil的上清液为粗酶液，测定木聚糖酶活力[5]，只留下相对酶活力较高的菌株，进一步分离纯化。反复培养筛选留下产木聚糖酶活力最高的菌株分别是B5-3、B5-1和S6-1（30℃培养），B1-1h和B1-2h（50℃培养）。
1.4菌种鉴定[7-14]
斜面或液体培养菌种，离心洗涤后用试剂盒提取DNA（按说明书操作）。采用引物与扩增条件，DNA测序与结果处理方法与文献[7-9]相同。通过检索对比分析初步确定到属[7-12]，然后从文献[13,14]查对相关属种的生理生化鉴定项目指标，用细菌生理生化微量鉴定管进行试验，补充实验及其他物质的利用按文献[13]中的有关方法配制实验。
1.5木聚糖酶活力测定
DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂法[5,7,9]。以1mL粗酶液1min产生相当于1μmol还原糖（以木糖计）的酶量定义为一个酶活力单位（IU）。
1.6pH和温度对菌株木聚糖酶粗酶液的影响[5,7,9]
1.6.1布列顿-罗宾逊（Britton-Robinson）缓冲液配制[14]。1 000mL溶液中含：3.92g H3PO4（2.71mL 85% H3PO4），2.40g HOAc（2.36mL冰醋酸），2.47g H3BO3（硼酸）。
按以上配方配制成5倍浓度的溶液，初始pH值在2～3范围（一般为2.2）。需要时，如：100mL，可取此液20mL，以2mol/L NaOH溶液在pH计下调到所需pH值，以蒸馏水定容至100mL即可。若定容为50mL则为2×浓度缓冲液。
1.6.2木聚糖底物溶液的配制。称取1.0g木聚糖于100mL调节好pH的缓冲液中，沸水浴加热溶解即可得1%（w/v）木聚糖底物溶液（溶解过程中经常摇动助溶）。长时间不用可冰冻保存，一般以4℃下贮存。
1.6.3pH对菌株木聚糖酶粗酶液与底物反应的影响。以2～13间隔1或0.5的不同pH之缓冲液，分别配制成木聚糖底物溶液，各底物液分别取360μL于0.5mL离心管中，加入40μL一定稀释度的酶液，用PCR仪设定在最适温度（未知最适温度前，则选择一个较适宜的温度）反应10min和95℃灭活酶保温10min。将反应物转入在1.5cm×15cm试管中，加入0.5mL DNS试剂，旋涡振荡器上混匀，煮沸10min后加蒸馏水4.1mL，测定OD540值。
1.6.4温度对菌株木聚糖酶粗酶液与底物反应的影响。在0.5mL离心管中加入40μL一定稀释度的酶液和360μL以最适pH缓冲液值配制的底物溶液，用PCR设定温度10～90℃度梯度反应10min，95℃保温10min，将反应物转入试管，加DNS试剂，煮沸，补水，测OD540值。
1.6.5菌株木聚糖酶粗酶的pH值稳定性。分别取不同pH值的2×浓度缓冲液0.5mL于1mL离心管中，加入以蒸馏水稀释至一定浓度的酶液0.5mL，在酶与底物最适反应温度下保温30min后，取80μL于1.5cm×15cm的试管中加入360μL以酶与底物反应最适pH值缓冲液配制的底物溶液，测定残存酶活力，以起始酶活为100%，计算酶相对存活率值。
1.6.6菌株木聚糖酶粗酶的温度耐受性。用酶与底物反应最适pH值缓冲液稀释至一定浓度的酶液分装于不同试管中，选择在包括酶与底物最适反应温度在内的几个不同温度下，分别水浴保温，间隔15min取样40μL于1.5cm×15cm的试管中，加入360μL以酶与底物反应最适pH值缓冲液配制的底物溶液，测定计算酶相对存活率值。
2结果与讨论
2.1分离选育木聚糖酶产生菌及菌株鉴定结果
2.1.1富集、分离和选育培养现象特征。30℃保温富集培养30d后液呈褐色或褐黄色，浓烈的粪臭味。在培养过程中，初期有大量气泡产生，中后期由少到无，封表面用的Mineral oil产生乳化现象。分离平板分2组，1组在50℃下培养，1组在30℃下培养。50℃下培养14d出现较少基内菌落，挑取19个单菌落于50℃下厌氧发酵7d检测酶活力有3个菌株无酶活，重复发酵仅1个菌株不产酶。30℃下培养7d出现基内菌落，挑取107个菌落于30℃下厌氧发酵7d检测酶活力，其中12个菌株无酶活，产酶菌株的比率为88.8%。结果说明：采用的富集与分离方法可行。
所得到产酶菌株经多次选育并纯化，最终留下50℃得到的B1-1h和B1-2h菌株，这2个菌株不能好氧生长。30℃得到的S6-1、B5-3和B5-1菌株是较明显的兼性厌氧菌。
S6-1菌株在普通牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基（简记：POP）上，37℃培养比30℃下生长快，37℃下48h菌落Φ3mm，暗白色，圆形，丰隆，有折光，边缘整齐。在木聚糖培养基上，37℃下48h菌落Φ1mm，灰白色，圆形盘状，有折光，边缘整齐。显微镜观察：在POP培养基上生长的菌体，形态多样，美蓝着色不均匀，24h内为少量杆状，多为近椭圆的短杆状；48h后菌体几乎全为球状。在木聚糖培养基上生长菌体美蓝着色均匀，为整齐的杆状菌体。
B5-3菌株需要补充维生素和适宜的无机盐溶液才能在POP培养基上生长。
B5-1菌株在POP培养基上37℃下生长48h，菌落Ф0.8～1.0mm光滑透明，有折光，边缘整齐。在木聚糖培养基上未见生长。该菌在30℃下较37℃下生长快。
2.1.2菌种初步鉴定结果。通过DNA测序及相似性比较[7-12]，YNUCC0237（S6-1）为Klebsiella sp.，B5-3为Enterococcus sp.，B5-1为Morganella sp.。B1-1h和B1-2h菌株均为Pseudomonas sp.，因不能在培养基表面好氧生长，只能较少地生长于厚培养基内，未作进一步生理生化鉴定。
依据伯杰氏手册[14]中“表8.11克雷伯氏菌属内的区分”、文献[13]中“表3-9克雷伯氏菌属的特性”和“表3-10肺炎克雷伯氏菌各亚种的鉴定特征”，结果见表1。从表1及补充实验甲基红“-”与V P反应“＋”，明胶水解“-”和葡糖酸盐形成2-酮葡酸盐与阿东醇均为“d”的结果中，抽出相应的测定特征列表对比分析（表略）结果表明：与DNA测序分析相一致，YNUCC0237（S6-1）菌株应是克雷伯氏菌属（Klebsiella Trevisan，1885）中的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），而且与肺炎亚种最接近。因无肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）模式种对比实验，由文献[13]数据初步鉴定为肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）。
同样，依据文献[13]中“表7-9肠球菌属种间鉴别”补充了表1所缺的一些特征实验。B5-3菌株有明显的运动性，与铅黄色肠球菌（Enterococcus casselifavus）最接近，但有较多特征又与鸟肠球菌（E. avium）或鹑鸡肠球菌（E. gallinarum）相同，因其保存困难，培养所需条件较苛刻，加上少数重要指标缺少试剂，B5-3暂归入肠球菌属（Enterococcus Thiercelin and Jouhaud，1984），若有必要时再深入研究。
在伯杰氏[14]中，摩氏摩根菌（Morganella morganii）是归入变形菌属为摩氏变形菌（Proteus morganii），1943年正式定为现名Morganella morganii（Winslow et al.）Fulton 1943，81。文献[13]中则是一个独立的摩根氏菌属（Morganella Fulton，1943），仅有摩氐摩根菌（M. morganii）模式种。分离到的B5-1菌株特征与文献[13]中“表3-15变形菌、普罗威登斯菌和摩根氏菌的鉴别特征”对照而归为摩氏菌属，与DNA分析一致。以文献[13]中“表3-4肠杆菌科种间鉴别表”在表1基础上补充实验结果见表2，尽管有些特征有差别，同样因无摩氐摩根菌（M. morganii）模式种对比实验，又因文献[13]中该属仅1个种，故将之B5-1菌株暂定为摩氐摩根菌（M. morganii）。
2.1.3对物质利用的补充实验。从表1～表3菌株对有机酸和挥发性有机酸的利用，B5-3菌株在有机酸盐下生长困难或不生长，该菌在实验用到的一般固体斜面上也较难保存。
B5-1菌株对柠檬酸完全不能利用外，在低pH值4.2下异丁酸、丙酸、富马酸均不能利用，但对甲酸能在30℃好氧条件下有一定的利用。
S6-1菌株对所有有机酸在一定条件下都能不同程度的有所利用，特别在低pH值4.2下对甲酸迅速利用，使pH上升液呈紫红色。另外的实验还显示，S6-1菌株有很强的脲酶作用；在30℃下能水解明胶；对氨基酸有较强的脱羧作用，能水解利用淀粉产酸，不产气；对羧甲基纤维素钠（CMC）利用产酸快于对淀粉。对木聚糖的利用有明显区别，有氧时几乎不利用，在厌氧时却能快速利用。
总之，除表1中按鉴定实验要求，S6-1菌株除不能利用松三糖、赤鲜醇和不具有苯丙氨酸脱氨酶、色氨酸脱氨酶外，对其他物质和补充实验物质均能有所利用或呈“＋”反应，说明该菌具有较广泛全面的“食谱”特性。而B5-1和B5-3菌株对物质的利用选择性极大。
2.2pH值与温度对菌株发酵产生的木聚糖酶酶活力影响
分离筛选出的适宜30℃生长的B5-1、B5-3和S6-1兼性厌氧菌株，3个兼性菌均可在固体平板上生长，仅后者S6-1菌株对营养要求较粗放。以50℃高温培养的B1-1h、B1-2h菌株均不能在培养基表面形成菌落。从表4可以看出各菌株以液体厌氧发酵，经离心得到的粗酶液对木聚糖底物的作用pH值和温度范围不相同，最适作用条件也不尽相同。
从图1可见3个兼性厌氧菌产生的木聚糖酶在无底物的不同pH值缓冲液下耐受特性，以酶在不同pH值下30min后相对存活率的残存酶活力衡量，B5-1菌株和B5-3菌株产生的木聚糖酶表现出很宽的pH值耐受性，B5-3菌株产生的酶在不同pH值中下跌较平稳，而B5-1菌株产生的酶在不同pH值中下跌差异很大。S6-1菌株产生的酶在pH值3以下或pH值8以上30min酶活完全丧失，30min存留的酶活力表现出以pH值5.5为最高点向两边下滑的现象。
对于S6-1菌株所产生木聚糖酶在酶与底物作用的最适pH值6.5下，酶存活率随时间变化。以起始酶活力为1（即100%），各时间下存活的相对酶活以小数表示，得到一条随时间延长酶活力逐渐下滑的曲线，其趋势线相关系数R=0.911 6；若将各值取以10为底的对数后，得到与时间关系的曲线Y=-0.008 1 logX-0.060 7，趋势线相关系数R=0.974 2。由此可认为，S6-1菌株的木聚糖酶活力在pH值6.5下呈一级动力学衰减，参见图2。
3个兼性菌中的B5-1和B5-3菌株的木聚糖酶分别在37℃、50℃、60℃和69℃下无底物保温，以起始酶活为100%，间隔一定时间取样测定的相对酶活残存率作图（图略）分析，B5-1菌株的木聚糖酶在37℃下120min仍有98%以上的酶活力；在50℃下120min时只有10%左右的酶活，90min时有高于96%的酶活；在60℃、69℃下30min分别仅有58%和36%的酶活。B5-3菌株产生的木聚糖酶在37℃下随时间延长酶活几乎是呈直线缓慢下降，120min时有78%的酶活；在50℃下60min以前酶活变化不大，60min以后酶快速下跌，至90min时有60%的酶活，120min时仅存2%左右的酶活；在60℃、69℃下30min分别为34%和56%的酶活；在60min内69℃下酶活下降速率小于60℃下酶活下降速率。
S6-1菌株产生的木聚糖酶对温度的耐受性是在室温（17℃）、30℃、50℃和65℃。由图3可见在室温和适宜发酵30℃温度下，90min以前酶活无损失稳定存在，90～150min下降13%左右的酶活；在酶与底物的最适反应温度50℃下，酶活以斜率-0.006 9的直线速度下跌（R=0.976 7）；在65℃下仅15min酶活就只残存2%左右。较低的温度较利于木聚糖酶的存活。
2.33个兼性厌氧菌摇瓶发酵与厌氧发酵产木聚糖酶活比较
菌株以玉米芯为原料的摇瓶发酵，S6-1菌株产酶相对高于另2个菌株，发酵过程液中的水解产物木糖累积变化特征正好与酶的产生累积变化特征相反，以B5-3菌株最为明显。
从图4可见，S6-1菌株在厌氧条件下产木聚糖酶水平远远高于好氧发酵条件下的产酶水平。说明该菌株在厌氧条件下对半纤维素的降解作用能力及产木聚糖酶量大于其在好氧状态。同时，另外2个菌株也有相同的特点，即在好氧条件下不产木聚糖酶或所产酶活极低；在厌氧条件下，对3个菌株都有接种量越大产酶越高的现象。B5-1菌株接种量最少不能低于1%；B5-3菌株需要较高浓度的B族维生素促进生长，接种量可适当低于1%。S6-1菌株具有较广谱的食性，接种量太少会使发酵控制变得很复杂；而较大接种量下产酶平衡，只需控制好温度，容易进行连续发酵产酶。
3讨论
研究的YNUCC0237（S6-1）为Klebsiella sp.，B5-3为Enterococcus sp.，B5-1为Morganella sp.。B1-1h和B1-2h菌株为Pseudomonas sp.。来源于沼气发酵的共存体系中，菌株分别有独自的条件与营养需求、有不同的生理生化等生物学特性。产生的木聚糖酶酶学特征也有很大差异。3个兼性菌B5-1、B5-3和S6-1菌株产生木聚糖酶主要是在厌氧条件下，特别是S6-1菌株产酶一般为40 IU，远高于报道的营厌氧生长的梭菌属Clostridium absonum CFR-702菌株产酶[6]。
从研究与文献资料[5,10,13,14,16-30]可知，不包括Klebsiella pneumoniae作为机会病原菌的调查研究，克雷伯氏菌属（Klebsiella）细菌是广泛存在的兼性厌氧菌[5,13,14,16,17]，具有广泛的食谱特性和代谢功能多样性[5,10,13,14,18-30]，对半纤维素来源的戊糖与己糖都能很好的利用，该属菌在国内外研究也较多，如：1,3-丙二醇氧化还原酶[24,25]，固氮[30]与其他[18-21,29]。特别是现今人们最为关心的环境与能源，克雷伯氏菌属细菌用于研究生物质能源利用的乙醇发酵[26-28]和生物质纤维[5,10]以及有毒物质[20,22,23]降解与利用[18,19]。而且在国内首例报道的产漆酶细菌就是克雷伯氏菌属的K. sp.601菌株[10]。也许是因为其广泛食性而存在或能形成丰富的酶系，以及有多样性的代谢，如本研究中的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae YNUCC0237（S6-1）菌株，在厌氧下能发酵甲醇，对乙醇为发酵型。其在厌氧与好氧下分别出现产木聚糖酶与极少产木聚糖酶的差别，这点上与酵母厌氧下产乙醇而好氧极少产乙醇有相同的特征，克雷伯氏菌与酵母的共同兼性特性，很易协同利用纤维质发酵产乙醇，通过深入研究对于燃料乙醇生产的相关工艺革新与进步将具有很大的潜力。S6-1菌株在厌氧下产木聚糖酶的特性与所产酶也利于导入促进生物质发酵产氢（H2）。
该研究证明了沼气发酵的厌氧条件下降解半纤维素的菌广泛存在，而且存在的菌除了代谢发生较大的变化外，其外形也发生变化，研究的S6-1菌株在厌氧条件无荚膜，而且在好氧条件下，特别限氮培养时产生很厚的荚膜，此荚膜多糖对于絮凝污水中污染物有较好的作用。S6-1菌株在厌氧和好氧下对能利用的糖类物质，在利用时几乎都是产酸产气的发酵。根据普遍认为的厌氧消化过程主要分为三个阶段的理论[31]，克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）的细菌在第一和第二阶段将起到重要的作用，正是这类型的兼性菌为产甲烷古菌创造了充分必要的物质与环境条件基础[32]。因此，应该重视这一大类兼性菌在厌氧与好氧下的特征，充分利用其不同功能的特性达到为人类服务目的。克雷伯氏属菌可认为是现今生物质可再生资源利用中较具潜力的兼性厌氧微生物菌种，其虽然与当今生产木聚糖酶的好氧菌相比，所产酶活力微不足道，但却远高于专性厌氧菌，而且其“两栖性”将对生物质降解利用生产能源或其它产品的特殊要求提供便利，其也是改善环境的可利用微生物资源。
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注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
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