摘 要：葡聚糖酶是分布较为广泛且参与植物生理活动的一类蛋白，研究烟草葡聚糖酶蛋白序列，对掌握其作用机制具有重要的意义。分别采用NETPHOS，SMART，MEM，CLUSTAL和MEGA工具检测并分析烟草葡聚糖酶的磷酸化位点、蛋白结构、保守基序和进化树。结果表明，NtBGl均含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸位点，其中NtBGl-2磷酸位点最多（分别为25，8，4个）；NtBGl均含有信号肽和O-糖基水解酶结构域，能够参与多种碳水化合物代谢过程，具有水解酶活性和水解O-糖基化合物的功能；NtBGl具有的核心保守基序区为Motif-1—Motif-2—Motif-7—Motif-5—Motif-3—Motif-4—Motif-6，NtBGl-1和NtBGl-2含有特异的Motif-8，Motif-9和Motif-10；烟草的葡聚糖酶与拟南芥聚为一类，且NtBGl-1和NtBGl-2属于亚组Ⅰ，NtBGl-3属于亚组Ⅱ。
关键词：烟草；β-1，3-葡聚糖酶；蛋白序列
中图分类号：S572 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.10.002
Abstract： Dextranase was a type of protein that is widely distributed and involved in plant physiological activities， and the study of dextranase protein sequence was of great significance to master its functional mechanism. NETPHOS， SMART， MEM， CLUSTAL and MEGA tools were used to detect and analyze the phosphorylation sites， protein structures， conserved motifs and phylogenetic tree of tobacco glucanase. The results showed that NtBGl contained the phosphorylation site of serine， threonine and tyrosine， NtBGl-2 had the most phosphorylation site， and the above three phosphorylation sites were 25， 8， and 4， respectively. NtBGl contained signal peptide and O- glycosyl hydrolase domain， and it could participate in many carbohydrate metabolism processes， and also had the function of hydrolase activity and hydrolysis of O- glycosyl compounds. The core area of a conserved motif in NtBGl was Motif-1 - Motif-2 - Motif-7 - Motif-5 - Motif-3 - Motif-4 - Motif-6， NtBGl-1 and NtBGl-2 also contained specific Motif-8， Motif-9 and Motif-10. The glucanase of tobacco was clustered with Arabidopsis thaliana， which NtBGl-1 and NtBGl-2 belonged to subgroup I， NtBGl-3 belonged to subgroup II.
Key words： tobacco； beta-1，3-Glucan； protein sequence
β-1，3-葡聚糖酶广泛分布在植物、细菌、藻类、真菌和病毒等组织中[1-3]，在植物体中的分布主要包括根毛、茎叶、薄壁细胞、细胞壁、花粉粒、花粉母细胞和胚珠等[4-5]，参与植物体的生长发育[6]。β-1，3-葡聚糖酶可通过降解病原菌的细胞壁，产生寡聚糖，形成寡糖激发子，进而促使植物体的抗病性增加[7-9]；类型Ⅰ的葡聚糖酶，其N-端和C-端均具有延伸序列，而类型Ⅱ的葡聚糖酶，仅N-端含有延伸序列[10-12]。
烟草领域有关β-1，3-葡聚糖酶的研究报道有很多，KAUFFMANN S等[12]研究发现烟草在受到烟草花叶病时，可产生4种葡聚糖酶（1种碱性，3种酸性），且酶活性大幅度提高；LINTHORST等[13]研究认为，烟草中应至少含有4个编码碱性的基因，7个编码酸性的基因；LEUBNER METZGER等[5]研究证实，β-1，3-葡聚糖酶具有使烟草种子解除休眠的作用。但有关烟草β-1，3-葡聚糖酶蛋白序列的研究较少。
笔者对烟草β-1，3-葡聚糖酶的蛋白序列进行分析，旨在为进一步了解烟草葡聚糖酶的作用机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 筛选烟草β-1，3-葡聚糖酶家族成员
采用PROTEIN[14]数据库在线检索，筛选烟草葡聚糖酶相关的蛋白序列，获取的登录号分别是AAA63541.1，ACF93731.1和AAA63542.1，依据优势氨基酸和氨基酸数进行命名，分别为NtBGl-1，NtBGl-2和NtBGl-3[15]。
1.2 方 法
采用NETPHOS[16]工具，檢测烟草葡聚糖酶含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点；采用SMART[17]工具，分析蛋白序列的信号肽位置和结构域分布；采用呈现蛋白序列保守性的MEME工具[18]分析保守基序，设定宽度为6～50，且E为10；采用CLUSTAL和MEGA工具[19]，对NtBGl成员进行序列比对，并构建进化树。
2 結果与分析
2.1 烟草β-1，3-葡聚糖酶的磷酸化位点的分析
在磷酸化位点，可通过磷酸化或去磷酸化的作用，对成熟的蛋白进行修饰，修饰后的蛋白结构发生改变，进而促使蛋白传递信号，或改变蛋白质活性，功能发生转化，对烟草葡聚糖酶的磷酸化位点进行分析，结果如图1所示。NtBGl-1含有23个丝氨酸（S）磷酸化位点，6个苏氨酸（T）磷酸位点，4个酪氨酸（Y）磷酸位点，磷酸化位点在N-端、中间区域和C-端均有分布，而在信号较高的区域主要分布在第100～200、275～350位氨基酸之间；NtBGl-2含有的磷酸位点最多，主要包括25个丝氨酸磷酸位点，8个苏氨酸磷酸位点，4个酪氨酸磷酸位点，信号较高的区域包括第100～200、275～350位氨基酸之间；NtBGl-3的磷酸位点数量最少，且分布较为分散，丝氨酸磷酸位点、苏氨酸磷酸位点和酪氨酸磷酸位点数量分别为10，7，3个，信号较高的区域主要集中在第75～125位和第260～300位氨基酸之间。
2.2 烟草β-1，3-葡聚糖酶的蛋白结构分析
蛋白序列所具有的结构决定该蛋白的功能特性，影响参与代谢的活动，因此，采用SMART对NtBGl的蛋白结构进行分析，详情如表1所示。NtBGl各成员均含有信号肽，位于N-端，信号肽的长度以NtBGl-2最大（1～32），NtBGl-1最小（1～21）；各成员均含有O-糖基水解酶结构域，但存在的位置有所差异，NtBGl-1的位置相对靠前，处于24～336之间，而NtBGl-2和NtBGl-3的位置相对靠后，处于32～347之间；含有O-糖基水解酶结构域的蛋白，能够延伸出乙酰肝素酶活性、多聚半乳糖醛酸酶活性、3-脱氧胞壁糖苷酶活性、3-脱氧-2-辛基糖苷酸酶活性、植物鞘氨醇酶活性和葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶活性等，且具有该结构域的蛋白，能够参与寡糖代谢过程、碳水化合物代谢过程的正调控、多生物碳水化合物代谢过程、细胞碳水化合物代谢过程和醛糖酸代谢过程等。
2.3 烟草β-1，3-葡聚糖酶的保守基序分析
通过对NtBGl各成员蛋白的保守基序进行分析，结果如图2所示。NtBGl序列含有10个保守基序，根据预测结果，对保守基序进行命名，依次为Motif-1～10，较为保守的基序含有7个，且各基序之间按照一定的顺序进行排列，该顺序为Motif-1—Motif-2—Motif-7—Motif-5—Motif-3—Motif-4—Motif-6，核心保守基序区（Motif-1—Motif-2—Motif-7—Motif-5—Motif-3—Motif-4—Motif-6）在3个NtBGl蛋白序列中均有存在；Motif-8，Motif-9和Motif-10只存在于NtBGl-1和NtBGl-2序列中，表明此蛋白序列具有保守性，同时具有特异性；根据烟草葡聚糖酶保守基序的分布和蛋白结构域，Motif-1与NtBGl的信号肽相关，Motif-2—Motif-7—Motif-5—Motif-3—Motif-4—Motif-6与O-糖基水解酶结构域相关。
2.4 烟草β-1，3-葡聚糖酶的进化树分析
运用NtBGl的氨基酸序列与大豆（ID： ABC70313）、番茄（ID： AAC49704）和拟南芥（ID： NP_191286，NP_191283和NP_191285）葡聚糖酶的蛋白序列进行同源比对，然后构建进化树，结果如图3所示。根据序列同源性，可将NtBGl分为2个类别：第1类烟草的葡聚糖酶成员与拟南芥的3个成员聚为一类，其同源性为100%，而NtBGl-1和NtBGl-2的同源性最高，且拟南芥的序列相似度最大，因此，可将NtBGl-1和NtBGl-2划分为亚组Ⅰ，而NtBGl-3为亚组Ⅱ；第2类为大豆和番茄的葡聚糖酶聚为一类，同源性为100%。通过进化树分析可知，烟草的葡聚糖酶仅与拟南芥相聚，表明NtBGl较为保守，而NtBGl-3与NtBGl-1和NtBGl-2被划分为2个亚组，表明NtBGl成员之间的功能发生分化。
3 结论与讨论
NtBGl均含有多个磷酸化位点，其功能的多样性与序列的磷酸位点数量关系较大，数量越多，其蛋白所具有的功能相对较多，NtBGl-2的磷酸位点最多（共37个），表明该蛋白的功能较多[20]；NtBGl-1和NtBGl-2的N-端和C-端具有延伸序列，即NtBGl-1和NtBGl-2可能属于Ⅰ类型葡聚糖酶（碱性β-1，3-葡聚糖酶），NtBGl-3无C-端延伸序列，即NtBGl-3可能属于Ⅱ类型（酸性β-1，3-葡聚糖酶）[10-12]；NtBGl含有O-糖基水解酶结构域，功能具有多样性；核心保守基序区（除Motif-1）与O-糖基水解酶结构域相关，NtBGl-1和NtBGl-2具有Motif-8，Motif-9和Motif-10，表明NtBGl的功能具有特异性；NtBGl与拟南芥聚为一类，表明NtBGl具有参与小孢子发育和花粉成熟的功能[21]。
参考文献：
[1]SUN L， GURNON J R， ADAMS B J， et al. Characterization of a β-1，3-Glucanase Encoded by Chlorella Virus PBCV-1 [J]. Virology， 2000， 276（1）：27-36.
[2]BACHMAN E S， MCCLAY D R. Molecular cloning of the first metazoan β-1，3 glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus[J]. Proc natl acad sci U S A， 1996， 93（13）：6808-6813.
[3]DOXEY A C， YAISH M W， MOFFATT B A， et al. Functional divergence in the Arabidopsis beta-1，3-glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression states[J]. Molecular biology & evolution， 2007， 24（4）：1045.
[4]ABELES F B， BOSSHART R P， FORRENCE L E， et al. Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves[J]. Plant physiology， 1971， 47（1）：129-134.
[5]LEUBNER-METZGER G， MEINS F. Antisense-transformation reveals novel roles for class I β-1，3-glucanase in tobacco seed after-ripening and photodormancy[J]. Journal of experimental botany， 2001， 52： 1753.
[6]何江峰， 韩冰， 赵宏鑫. 植物β-1，3-葡聚糖酶的研究进展[J]. 北方农业学报， 2006（5）： 21-25.
[7]HAM K S， WU S C， DARVILL A G， et al. Fungal pathogens secrete an inhibitor protein that distinguishes isoforms of plant pathogenesis-related endo-β-1，3-glucanases[J]. Plant journal， 1997， 11（2）：169-179.
[8]蒋选利， 李振岐， 康振生. β-1，3-葡聚糖酶与植物的抗病性[J]. 西北农业学报， 2005， 14（4）： 135-139.
[9]PAZLAGO D. Biological relevance of beta 1，3 glucanase enzyme to activate the systemic resistance of tobacco as induced by fungal cell wall[J]. Cultivos tropicales， 1998.
[10]KEEFE D， HINZ U， MEINS F. The effect of ethylene on the cell-type-specific and intracellular localization of β-1，3-glucanase and chitinase in tobacco leaves[J]. Planta， 1990， 182（1）：43-51.
[11]NEUHAUS J M， FLORES S， KEEFE D， et al. The function of vacuolar β-1，3-glucanase investigated by antisense transformation. Susceptibility of transgenic Nicotiana sylvestris plants to Cercospora nicotianae infection[J]. Plant molecular biology， 1992， 19（5）：803-813.
[12]KAUFFMANN S， LEGRAND M， GEOFFROY P， et al. Biological function of pathogenesis-related proteins： four PR proteins of tobacco have 1，3-beta-glucanase activity[J]. Embo journal， 1987， 6（11）：3209-3212.
[13]LINTHORST H J， MELCHERS L S， MAYER A， et al. Analysis of gene families encoding acidic and basic beta-1，3-glucanases of tobacco[J]. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America， 1990， 87（22）： 8756-8760.
[14]EDGAR R， DOMRACHEV M， ALEX E. et al. Gene Expression Omnibus： NCBI gene expression and hybridization array data repository[J]. Nucleic acids research， 2002， 30（1）： 207-210.
[15]陈二龙， 苏家恩， 范志勇， 等. Bright Yellow 2烤烟热激蛋白90生物信息学分析[J]. 南方农业学报， 2017， 48（10）： 1734-1740.
[16]INGRELL C R， MILLER M L， JENSEN O N， et al. NetPhos Yeast： prediction of protein phosphorylation sites in yeast[J]. Bioinformatics， 2007， 23（7）： 895-897.
[17]SCHULTZ J， MILPETZ F， BORK P， et al. SMART， a simple modular architecture research tool： identification of signaling domains[J]. Proceedings of the national academy of sciences， 1998， 95（11）：5857-5864.
[18]BAILEY T L， ELKAN C. The value of prior knowledge in discovering motifs with MEME[J]. Procint conf intell syst mol biol，1995， 3：21-29.
[19]LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics， 2007， 23（21）： 2947-2948.
[20]朱峰， 馮建国， 钱坤， 等. 核糖体失活蛋白生物信息学分析[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版）， 2016， 37（1）： 113-118.
[21]张丽， 魏崃， 唐晓飞， 等. 大豆β-1，3-葡聚糖酶（GmBG1）及其同源蛋白的生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2017（3）： 1035-1042.
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