利用环介导等温扩增技术快速检测饮用水中的大肠杆菌

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Dj�zt��y��ܰ?�������0�ML�����i�V���"http://www.gzzcxlzx.com/t/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用菌种包括2株大肠杆菌目的菌株和金黄葡萄球菌等9株非目标菌株，菌株信息详见表1。纯净水均购自济南某超市。

1.2 试剂与仪器

Ex Taq 酶、dNTPs、10×Buffer、DNA分子量Marker DL2000、电泳上样缓冲液、BestarTM Real time PCR Master Mix（SYBR Green法）等PCR反应试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物与探针由生工生物工程（上海）有限公司负责合成，BstDNA聚合酶购自NEB公司；Taq DNA Polymerase、甜菜碱（betaine）购自Sigma公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。

凝胶成像仪 BIO-RAD和超微量分光光度计NanoDrop 2000购自Thermo公司，DNA测序仪ABI 3730XL和荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，普通PCR仪购自德国Eppendorf公司，高速离心机5424D型购自Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 LAMP引物设计与合成 根据GenBank中公布的大肠杆菌malB基因序列（EU118059.1），利用在线引物设计软件PrimerExplorer V4设计LAMP引物，4条引物分别为两条内引物（FIP/BIP）和两条外引物（F3/B3），详细序列信息见表2。

1.3.2 DNA模板的制备 将大肠杆菌菌株接种于YT培养基上37℃过夜培养，并将培养好的菌株按照TIANGEN细菌提取试剂盒说明书要求进行基因组DNA的提取。利用核酸定量测定仪测定提取基因组DNA的质量，-20℃保存备用。

1.3.3 LAMP技术检测大肠杆菌反应条件的优化 LAMP反应体系由外引物（F3/B3）、内引物（FIP/BIP）、BstDNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、ddH2O和核酸模板组成。对反应温度、反应时间、dNTPs浓度和甜菜碱等条件进行优化，确定最佳反应体系。反应温度在50.0～70.0℃之间，按照5℃梯度递增；反应时间在30～70 min之间按照10 min的反应梯度递增；dNTPs设置5个浓度，依次为0.05、0.1、0.2、0.3 mmol/L和0.4 mmol/L，在试验过程中保持等量模板和一个变量。在其他条件均优化好的前提下，分别加4 mol/L的甜菜碱0.25、0.5、0.75、1.0 μL和1.25 μL梯度进行试验，取5.0 μL LAMP扩增产物点样，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳的反应条件。

1.3.4 LAMP特异性试验 利用优化后的反应条件，对大肠杆菌目的菌株和金黄葡萄球菌等9株非目标菌株进行LAMP扩增，应用熒光染料剂SYBR Green Ⅰ进行显色，在紫外光下观察检测扩增结果，并将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证该方法的特异性。

1.3.5 LAMP灵敏度试验 取过夜培养的大肠杆菌菌液，然后按10倍浓度梯度稀释至10-8，原始菌液浓度为1.35×106 CFU/mL，37℃平板上过夜培养，测定纯培养的大肠杆菌的活菌数。同时将各稀释菌液利用TIANGEN细菌提取试剂盒提取DNA，取2.0 μL作为模板进行LAMP扩增，检测该方法的灵敏度。

1.3.6 LAMP检测大肠杆菌方法的验证 10种不同品牌的纯净水，经16S rDNA鉴定均为阴性样本，将每种纯净水各取1.5 mL分别加入500 μL大肠杆菌菌液，以不加任何目的菌液的纯净水为对照。所测样品采用TIANGEN细菌基因组试剂盒提取DNA，按照优化后LAMP反应体系和条件进行扩增，取5.0 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时根据反应之前加入的SYBR Green Ⅰ荧光染料在紫外灯下进行检测，若颜色呈现绿色则判读为阳性。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应体系及反应条件的确定

根据试验条件参数的优化，大肠杆菌最佳的反应体系为：F3/B3（0.4 μmol/L）1.0 μL，FIP/BIP（2.4 μmol/L）3.0 μL，BstDNA 聚合酶（8 U/μL）1.0 μL，甜菜碱（4 mol/L） 0.75 μL，酶缓冲液2.5 μL，dNTPs（0.2 mmol/L）2.0 μL，DNA模板（10 ng/μL） 2.0 μL，补水至25 μL。通过梯度试验条件优化，最终确定大肠杆菌反应条件为60℃ 60 min，80℃ 5 min终止反应（图1～4）。

2.2 LAMP特异性验证

根据建立的LAMP反应体系和条件，对大肠杆菌和非目标菌（金黄葡萄球菌、化脓链球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、赫氏埃希氏菌、停乳链球菌、嗜热乳酸链球菌、解淀粉芽孢杆菌）进行检测。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，大肠杆菌扩增出阶梯状条带，且清晰，其他非目标菌株均未扩增出条带，表明LAMP扩增对大肠杆菌具有较好的特异性（图5）。在反应之前加入SYBR Green Ⅰ荧光染料，等反应结束在紫外灯下观察，大肠杆菌组呈现绿色（图6）。

2.3 LAMP灵敏度试验

对大肠杆菌的纯培养菌液按10倍梯度进行稀释后分别提取基因组DNA，进行LAMP扩增，然后取5.0 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。可以看出，稀释到10-6时（大肠杆菌浓度为1.35 CFU/mL）仍能扩增出阶梯状条带，继续稀释则没有扩增条带。因此，LAMP扩增检测大肠杆菌灵敏度达到1.35 CFU/mL，证明LAMP技术具有较高的灵敏度（图7）。

2.4 供试样品检测

对供试样本按照优化的LAMP反应体系进行检测，取5.0 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，未添加大肠杆菌的纯净水样品均为阴性，加入大肠杆菌的供试样本检测均为阳性（图8）。紫外光下加入大肠杆菌的纯净水样品颜色为绿色，判读为阳性（图9）。

3 讨论与结论

受到致病性大肠杆菌污染的水会危害人体健康，能够引起中毒，导致呕吐、腹泻等症状。对于大肠杆菌的快速检测主要集中于以PCR为基础的分子检测方面，但相关PCR检测需要昂贵的设备，在基层检测上很难得到推广应用。本研究建立的LAMP扩增技术具有以下优势：1）操作简便，避免污染。试验操作过程中可以一次性加入试剂、合成酶和SYBR Green Ⅰ染色剂，可以有效避免开盖过程中的交叉污染，避免造成假阳性影响检测结果，产生试验误差。2）试验需要的仪器要求低，价格便宜。LAMP体系扩增反应保持在60℃左右，因此试验过程中只需要恒温PCR仪或恒温水浴锅即可完成反应，与荧光PCR扩增技术相比，不需要昂贵的检测设备。判定结果除可使用凝胶电泳法检测外，还可利用荧光染料在紫外灯下直接观测。3）特异性强，灵敏度高。本研究中大肠杆菌的检测灵敏度为1.35 CFU/mL。

恒温介导扩增技术（LAMP）与其他分子生物学技术相比，具有较高的灵敏度。Yokoyama等[13]也报道了LAMP扩增技术与PCR扩增相比具有较高灵敏度。Wang等[14]利用MERT-LAMP检测技术检测沙门氏菌灵敏度达到125 fgDNA/反应。在不同的试验中检测灵敏度存在较大差别，可能与引物设计时选择的靶基因不同有关，也可能与反应体系中化学试剂、酶活性、金属离子浓度有关。目前，在食品致病菌方面报道的大肠杆菌靶基因有LT[10]、VT[15]、rfbE[16]和malB[8]，本研究选择的malB基因具有高度保守性，可以特异性地扩增出大肠杆菌。该方法可以对大肠杆菌进行有效的检测，为水中致病菌的检测提供广泛快速的技术手段。

参 考 文 献：

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