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摘要：以大肠杆菌作为研究对象，对菌种活化、传代、培养、涂片、染色等过程中影响形态的变量进行研究。结果用细菌标本片和影像记录的方式呈现形态变化规律，探究典型大肠杆菌形态的条件，即采用革兰氏染色的方法，分别对培养8～24 h的大肠杆菌进行涂片染色，中间每2 h涂1次片，最后在显微镜下统一进行镜检观察。大肠杆菌在培养8～16 h时，形态特征表现明显，呈现短杆状。在革兰氏染色过程中应注意控制菌龄和染色时间。
关键词：大肠杆菌;革兰氏染色法;形态观察;变化规律
中图分类号：Q93-33 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.06.003
Abstract：In this experiment，Escherichia coli was studied by means of activation，generation，culture，smear and staining，which were variables of affected morphology. It was showed by using bacterial specimens and image recording to study the culture conditions of typical E. coli morphology. The methods of gram staining were used for E. coli which were cultivated from 8～24 h and gram stained once every 2 h respectively，and were finally observed under microscope together. In the cultivation from 8～16 h，the morphological characteristics of E. coli were obvious and showed a short rod shape，which were typical morphological features. It should be paid attention to control of fungus age and dyeing time in the process of gram"s staining. It will provide morphological pictures and experimental parameters for research and application，which are related to E. coli.
Key words：Escherichia coli;gram staining method;morphological observation;law of change
大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli），又称大肠杆菌，是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）的代表菌。因Escherich在 1885 年发现而得名[1]，因其具有结构简单、需要的营养物质简单、易于培养、繁殖速度快、分布广等特点，无论在科学试验研究中，还是在食品安全和相关疾病研究中，常作为载体菌、指示菌、病原菌备受广大科研工作者的关注[2]。如何快速检测样品中的大肠杆菌是研究者几十年来一直亟待解决的问题，特别是大肠杆菌生长过程中的形态、染色特性等基本内容[1]。试验通过革兰氏染色的方法，对培养8～ 24 h大肠杆菌的形态特征进行研究，对今后更好地控制和利用大肠杆菌，具有指导意义和参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
标准菌株：Escherichia coli ATCC：25922（大肠杆菌），购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，以下命名为E. coli-1。
试验菌株：来自于实验室保藏菌株，以下命名为E. coli-2。
1.1.2 试验仪器与设备
KDC-140HR型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品;CP522C型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品;WPL-230BE型电热恒温培养箱、BBS-SDC型洁净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司产品;GR60DA型立式自动压力蒸汽灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司产品;DM500+ ICC50Leica型显微镜，德国徕卡仪器有限公司产品。
1.1.3 试验药品
革兰氏染色液，南京建成生物工程研究所提供;胰蛋白胨（生化试剂），国药集团化学试剂有限公司提供;酵母提取粉（生化试剂），广东环凯微生物科技有限公司提供;琼脂（生化试剂），天津市英博生化试剂有限公司提供;氯化钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司提供。
1.1.4 培养基的调配
①LB液体培养基的配制。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，搅拌均匀，调pH值为7.4。②LB固体培养基的配制。将LB液体培养基调pH值后，再加入琼脂15 g，加热、搅拌至沸腾。将配置好的LB液体培养基分装到试管中，固体培养基分装到锥形瓶内，于121 ℃灭菌20 min[3]。
1.2 方法
1.2.1 菌株的活化与保藏
将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，于37 ℃下恒温培养24 h，如此再重复2次，穿刺保藏于LB半固体培养基中，37 ℃下恒温培养24 h，于4 ℃保藏不同时间，备用。
1.2.2 不同生长阶段形态的研究
分别对培养8～24 h的大肠杆菌进行涂片染色，中间每2 h涂1次片，观察形态并记录。
1.2.3 供试菌液制备
将保藏的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，活化到三代，于37 ℃下恒温培养24 h，以转速3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用生理盐水洗涤（每次 5 mL，反复离心洗涤3次），即得供試菌液[4]。
1.2.4 涂片的制备、干燥与固定
（1）涂片。采用传统常规涂菌[4]。试验将待观察的大肠杆菌培养8～24 h，每隔2 h从37 ℃恒温箱中取出1试管的菌液进行离心（以转速3 000 r/min离心10 min），然后将离心好的菌泥在超净台中用接种环从离心管中挑起满环或者半环进行涂片。
（2）干燥。将涂片放到灭菌的超净台中，于室温下进行干燥[4]。
（3）固定。采用火焰固定法。
1.2.5 革兰氏染色
初染（草酸铵结晶紫）设定了1，2，3 min;媒染（革兰氏碘液）1 min;脱色（95%的乙醇）设定了30 s和1，2，3 min;复染（番红染色液）1 min。步骤采用传统染色法[5]。
2 结果与分析
2.1 不同培养时间大肠杆菌形态特征
将大肠杆菌活化2代，将第3代菌分别培养8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并分别对其进行标准革兰氏染色，用油镜（100×）进行观察。
大肠杆菌E. coli-1，E. coli-2培养8～24 h的形态特征见表1。
由表1可知，经过标准的四步革兰氏染色法对菌体进行涂片染色后，大肠杆菌都呈现红色。其中培养8～16 h的大肠杆菌呈现短杆状比较明显，到了18～24 h大肠杆菌的形态变得无规则。这是因为细菌在适宜的培养条件下，一般十几个小时即进入对数生长期。如果菌龄过长，菌体会出现异常形态[6]。
2.2 草酸铵结晶紫初染时间对大肠杆菌形态观察的影响
用草酸铵结晶紫对培养16 h的大肠杆菌E. coli-1进行染色1～3 min，每种情况涂片10张。
草酸铵结晶紫染色1 min见图1，草酸铵结晶紫染色2 min见图2，草酸铵结晶紫染色3 min见图3。
由图1 ～图3可知，草酸铵结晶紫对大肠杆菌染色1～3 min的染色效果是相同的，所以在染色时采用草酸铵结晶紫染色1 min，可以节省染色所消耗的时间。
2.3 酒精脱色时间对大肠杆菌形态观察的影响
用培养16 h的大肠杆菌E. coli-1涂片分别进行1，2，3 min不同脱色时间试验，每种情况涂片10张。
脱色1 min见图4，脱色2 min见图5，脱色3 min见图6。
由图4 ～图6可知，由于涂片时涂菌厚度较一般涂片厚，因此在酒精脱色的过程中时间从30 s延长至1，2，3 min进行观察后发现，酒精脱色3 min时观察效果最佳，所以其余涂片染色时都把酒精脱色延长至3 min。同时应减少取菌量，降低细菌堆积密度，以防涂片菌膜浓厚时会因大肠杆菌密集成堆而不易脱色或脱色不完全，呈现假阳性反应[7-9];而如果涂片太薄、大肠杆菌数量太少，观察时难以寻找到合适视野[10]，所以涂片厚度也应该保持适中。
2.4 番红复染时间对大肠杆菌形态观察的影响
用培养16 h的大肠杆菌E. coli-1涂片分别进行复染1，2，3 min试验，每种情况涂片10张。
番红染色1 min见图7，番红染色2 min见图8，番红染色3 min见图9。
由图7 ～图9可知，当番红对大肠杆菌进行1～ 3 min染色时，其染色效果相同，所以在给大肠杆菌进行番红染色时，选择染色1 min，这样既可以对大肠杆菌进行染色观察，又缩短了对大肠杆菌的整体染色时间。
3 结论
大肠杆菌在培养8～16 h时，形态特征表现明显，呈现短杆状;到了18～24 h形态变得无规则。草酸铵结晶紫初染和番红复染对革兰氏染色结果影响较小，乙醇脱色时间对革兰氏染色结果有较大影响，在对菌体染色过程中，应注意控制好菌龄和脱色时间[11-12]，才能得到正确的染色结果，以便于正确区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，进而可帮助临床对食物中毒原因及所用药物做出正确选择[5]。
参考文献：
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