【摘要】目的探讨呋硼散坐浴结合5-Fu局部注射治疗外阴尖锐湿疣对皮损处HPV病毒DNA含量、P16蛋白表达及病理形态学的影响。方法用FQ-PCR技术、免疫组化技术、光镜观察分别检测2009年5月至2011年5月外阴及肛周尖锐湿疣患者28例应用呋硼散结合5-Fu治疗前后位HPV病毒含量、P16蛋白表达及病理形态学变化。结果治疗前后HPVDNA含量、P16蛋白的表达均有统计学差异，病理形态学可见明显改变。结论病理形态学、HPVDNA病毒含量、P16蛋白表达是评价5一FU局部注射加呋硼散坐浴是治疗尖锐湿疣疗效的客观有效的方法。
【关键词】尖锐湿疣；呋硼散；5-氟尿嘧啶；HPVDNA；P16；病理形态学
尖锐湿疣（condylomaacuminatum，CA）是生殖道常见的性传播疾病，患病率有增加趋势，目前已成为发病率第2的性传播疾病。CA多为低危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染，与HPV6型和11型关系尤为密切。细胞周期相关蛋白在病毒感染及肿瘤发生中的作用日益受到关注，包括细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependentkinases，CDK）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白（cyclin-de-pendentkinasesinhibitoryprotein，CKI）的改变与HPV感染引起的上皮细胞过度增殖及恶变的关系密切［1］。我院于2005年5月至今采用呋硼散结合5.FU治疗CA患者，疗效很好，且不良反应减轻显著。2009年以来治疗前后笔者分别用免疫荧光PCR法分别检测HPV6、11的病毒含量；用免疫组化检测P16蛋白的表达；以及病理形态学变化衡量呋硼散结合5-氟尿嘧啶的疗效。
1资料与方法
1.1临床资料选择濮阳市妇幼保健院2009年5月至2011年5月妇科门诊女性CA患者48例，年龄17-48岁，平均年龄32岁，病程1周-6月，皮损多位于生殖器及肛周，形态多为乳头状、菜花状、丘疹样I皮损大小0.1-3cm。尖锐湿疣病理学改变典型，5%醋酸白实验阳性。
1.2研究方法将患处皮肤常规消毒，5-氟尿嘧啶10mL皮损下注射，并用醋酸白试验检查其他皮肤，如有皮肤变白的地方，亦m5一FU皮损下注射。术后开始呋硼散209溶于2000mL温开水中坐浴，1次／d，每次30min，以30d为1个疗程。患者均在初次就诊活检、治疗的第30天时采取相同部位活检，所有标本手术切除之后从中间剖开，一块置于生理盐水中［2］：另一块10%福尔马林固定，石蜡包埋。石蜡包埋标本切片、HE染色，光镜观察可见尖锐湿疣典型病变。然后进行免疫组化及另一块置于生理盐水中用于FQ-PCR［fluorescentquantitationpolymerasechaieaction］荧光定量聚合酶链反应检测HPV6、11的病毒含量。
尖锐湿疣的光镜典型表现：多为多发性乳头状瘤或丘疹状。棘层肥厚，基底层增生，表皮上部有挖空细胞形成。常见角化亢进或角化不良、双核和多核角质细胞。上皮脚延长增粗。下方结缔组织中常有慢性炎细胞浸润。
其一标本置试管中加入1.0mL无菌生理盐水，用研磨器将组织研碎，加DNA提取液充分震荡摇匀，离心弃上清。沉淀加50mLDNA提取液充分混匀沸水浴10min，转至4℃静置6-8h以保证充分裂解。离心5min，取上清液5mL进行PCR反应，进行40个循环。PE5700全自动分析仪分析检测。记录HPVDNA6/11型病毒含量。FQ_PcR试剂为中山医科大学安达基因诊断中心提供的HPV6／11型荧光定量PCR诊断试剂盒；仪器为美国PE公司生产的PE5700全自动实时荧光定量PCR仪。
鼠抗人p16蛋白单克隆抗体、兔抗人Rb多克隆抗体及SP免疫组织化学染色试剂盒为美国SantaCruz生物技术有限公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。免疫组织化学技术采用sP法，主要工作流程按说明书操作，实验设空白对照（用PBS代替一抗），同时用已知阳性片作阳性对照。免疫组化染色阳性为棕黄色，不着色为阴性；p16蛋白定位于细胞核［3］。每张阳性切片选取5个高倍视野（X400），计算500个角质形成细胞中阳性细胞所占百分比。（—）表示无阳性细胞；（+）表示阳性细胞数<25%；（++）表示阳性细胞数25%-50%；（+++）表示阳性细胞数50%-75%；（++++）表示阳性细胞数>75%［4］。
1.3统计学方法采用SPSSl0.0统计软件，两样本t／t’检验、X2检验，以P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1患者治疗前HPV6/11型DNA含量均数为1.21x107（copy／Ml），治疗后43例转阴，5例病毒含量显著下降，均数为（30.5（copy／Ml））患者治疗前后病毒含量差异有显著性（P<0.05），见表1。
2.2P16在治疗前后的表达阳性表达主要位于空泡细胞及其周围棘细胞，少数散在于棘细胞各层。治疗前38人（++），4人（+），计42人阳性，阳性率为87.5%，治疗后3人（+），阳性率为6%，二者存在统计学差异，见表2。
2.3治疗前48人均有尖锐湿疣病理学典型病变多发性乳头状瘤或丘疹状。棘层肥厚，基底层增生，表皮上部有挖空细胞形成。常见角化亢进或角化不良、双核和多核角质细胞。上皮脚延长增粗。下方结缔组织中常有慢性炎细胞浸润。
治疗后相同部位活检光镜观察：45例乳头瘤样增生消失，挖空细胞消失；41例角化不良或角化亢进少见；46例真皮内可见少许慢性炎细胞浸润。疗效明显。
3讨论
尖锐湿疣是一种良性肿瘤，形成具有纤维血管轴心的乳头状结构，乳头表面被覆鳞状上皮，并有HPV感染的证据，一般有挖空细胞形成。女性下生殖道包括外阴，阴道、宫颈、肛周是病变的好发部位，外阴最多见，宫颈次之。外阴尖锐湿疣多生长于小阴唇外侧、前庭处和大阴唇，尚有会阴、肛周等处。典型病变多为多发性乳头状瘤或丘疹状。感染女性下生殖道的HPV有6.11.16.18.33.35亚型，其中有代表的为低危型HPV6／ll型［5］。主要与尖锐湿疣有关。现在普遍认为，生殖道HPV感染在鳞状上皮细胞增生中具有重要作用。增生的启动是由于这两种病毒癌基因E6、E7的过度表达而引发，它们与多种细胞周期蛋白相互关联。正常细胞周期进程是在一系列细胞周期调节蛋白的调控下通过DNA合成和有丝分裂而完成的。若细胞周期异常或癌基因活化和抑癌基因失活，细胞将进入异常增殖状态，造成细胞过度增殖，凋亡减少，最终导致癌变发生。p16基因是1994年发现并命名的一个细胞周期调节基因—j，在许多癌的发生中有重要作用。P16是一种Cyclin依赖激酶抑制剂，为肿瘤抑制蛋白，抑制CDK4和CDK6，调节G1节点，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞的无限增殖，是CIN标记物［6］。本研究尖锐湿疣中HPVDNA含量较高，P16蛋白阳性表达主要位于空泡细胞及其周围棘细胞，少数散在于棘细胞各层。治疗后组中HPVDNA含量明显降低，P16蛋白表达几乎为阴性，提示HPVDNA含量、P16蛋白表达以及治疗前后病理形态学的明显差异可作为治疗尖锐湿疣疗效评价的指标。
尖锐湿疣治疗方法多采用局部疗法，治疗原则是去除疣体，这就会对局部皮肤或黏膜造成刺激，形成红肿硬斑或创面形成。且外阴及肛周分泌物易积聚，环境湿润，局部潮湿、月经及妊娠期尤为显著，这就造成创面愈合缓慢，易继发感染，疼痛明显降低了患者的耐受力，降低了依从性，这些均增加了CA治疗的难度、降低治疗CA的疗效及增加CA的复发率。因此，促进创面愈合.红肿硬斑的消退及局部环境的改善是治疗本病的关键。呋硼散是硼酸与呋喃两林的复合制剂，有收敛及局部抗菌作用，能改善局部的血液循环、消除水肿。促进上皮纤维组织和上皮细胞的再生。呋硼散用于尖锐湿疣局部治疗后，对于创面的愈合及红肿硬斑的消退均效果极好，且疼痛改善明显，并对于尖锐湿疣的疗效及复发亦起到很大的作用。且呋硼散价格便宜，疼痛改善明显，这大大提高了患者依从性［7-8］。
呋硼散应用到治疗尖锐湿疣以来，疗效的评价大多是主观性的、难量化的指标。2009年以来我院临床医生与病理科医生严密合作，将病理形态学变化、HPVDNA含量、P16蛋白的表达纳入尖锐湿疣疗效的量化指标，使呋硼散治疗尖锐湿疣的疗效评价行之有据，诉之可信。
参考文献
［1］梁俊，杜娟，杨永生，林尽染，金晶，徐金华.p16在尖锐湿疣和鲍温样丘疹病中的表达.中国临床医学，2011年18卷06期：746-748页.
［2］倪文琼，屈卫东，陈晨，张褒佳.局部免疫调节剂咪喹莫特对尖锐湿疣患者皮损处HPV百度DNA含量的影响.中国麻风皮肤病杂志，2006年22卷02期：131-132页.
［3］郭书萍，白莉，冯艳.P16蛋白表达在鲍温样丘疹病与尖锐湿疣鉴别诊断中的意义.中国药物与临床，2006年6卷，第09期.
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［5］郭书萍，陈丽瑛，白莉.尖锐湿疣、鲍温样丘疹病及鲍温病皮损中人乳头瘤病毒感染与P16蛋白表达的关系.中华皮肤科杂志，2002年第03期.
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［7］匡钱华，董林，沈明娟.中西医结合治疗尖锐湿疣疗效观察.中国中医药信息杂志，2009年16卷08期：77-78页.
［8］匡钱华，沈明娟，董林.祛疣煎剂治疗尖锐湿疣亚临床与潜伏感染疗效观察.中国中医药信息杂志，2009年16卷04期：65-65页.
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