摘要：目的 探讨我院临床分离鲍曼不动杆菌的耐药性及外排泵adeB基因存在状况。方法 WHONET5.6回顾性分析鲍曼不动杆菌耐药性，聚合酶链反应(PCR)扩增检测adeB基因。 结果 2011年，鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物均较敏感，耐药率几乎均在40%以下，2012年出现较大幅度上升，对5大类抗菌药物的耐药率几乎均在50%以上，2013年变化不明显；鲍曼不动杆菌外排泵adeB基因阳性率高(80.9%)，多重耐药菌adeB基因阳性率(89.7%)明显高于相对敏感菌adeB基因阳性率(37.5%)(P<0.05)。结论 鲍曼不动杆菌耐药情况严重，adeB基因阳性率高；主动外排在鲍曼不动杆菌多重耐药中可能发挥重要作用。
关键词：鲍曼不动杆菌；外排泵；adeB基因
Investigation of Acinetobacter Baumannii Drug Resistance and Analysis of Existence of Efflux Pump AdeB Gene
WU Ze-cai1,DENG Zheng-hua1,LUO Qian2
(1.Department of Laboratory Medicine,The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First People"s Hospital of Neijiang City, Luzhou 646000,Sichuan,China)
Abstract：Objective To investigate the drug resistance of Acinetobacter baumannii clinical isolates in our hospital and the existence of efflux pump adeB gene. MethodsAnalysis retrospectively of drug resistance of Acinetobacter baumannii based on WHONET5.6. And the polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify the adeB gene. ResultsIn 2011, acinetobacter baumannii were sensitive to the cephalosporin class, carbon penicillium alkene, β- lactamase inhibitor, fluoroquinolone and aminoglycoside antibiotic drugs, The resistant rates to almost were all below 40%.But it appeared a relatively substantially rise in 2012, the resistance rates to five categories of antibacterial drug were all above 80%.there were no change obviously in 2013.The rate of efflux pump adeB gene in acinetobacter baumannii is high(80.9%). The positive rate of adeBgene in multi-resistant bacteria(89.7%) was significantly higher than sensitive bacteria (37.5%) (P< 0.05). ConclusionThe drug resistance of Acinetobacter baumannii is in severe cases ,and the detection rate of adeB gene is high. The active efflux pump might play an important role in the formation of multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii.
Key words：Acinetobacter baumannii; Efflux pumps; AdeB gene鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)广泛存在于医院环境中，如医护人员的手部、患者用具、呼吸机设备、消毒液、透析机、水龙头等，是最常见的条件致病菌之一，可以引起多种医院感染，如肺炎、伤口感染、败血症和脑膜炎等。随着抗菌药物的广泛使用，多重耐药AB不断发展，给临床治疗带来很大困难，研究AB耐药情况，可为合理选择抗菌药物，采取有效治疗措施防止耐药菌株进一步扩散提供理论依据。为探讨耐药情况及耐药基因存在状况，本研究对近3年我院临床分离AB耐药性进行了回顾性分析，对部分菌株进行了外排泵基因adeB检测和分析。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1菌株47株AB分离自2011年1月~2013年12月我院门诊和住院患者送检的各类标本，所有菌株均采用西门子公司MicroScan WalkAway-96 plus细菌鉴定和药敏测试系统进行鉴定和药物敏感试验。其中相对敏感菌(对氨基糖苷类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类均较敏感)8株，多重耐药菌(对头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类中的3类及以上耐药）39株。质控菌株为大肠埃希菌25922，铜绿假单胞菌27853。
1.1.2仪器与试剂西门子公司MicroScan WalkAway-96 plus鉴定和药敏测试系统，配套试剂及NC50反应板；C1000TM Thermal Cycle PCR扩增仪与凝胶成像仪为Italy Bio-RAD公司产品；引物及试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；培养基均购自重庆庞通医疗器械有限公司。
1.2方法
1.2.1细菌鉴定与药敏试验病原菌的分离、鉴定和药敏试验严格按临床检验操作规程及仪器说明书进行。
1.2.2细菌耐药性分析用WHONET5.6软件回顾性分析我院2011年~2013年临床分离AB的药物敏感性资料。
1.2.3 adeB基因检测
1.2.3.1模板制备将保存的细菌接种于血平板上，置于37℃ CO2培养箱孵育18~24h后，采用煮沸法[1]，挑选纯菌落置入EP管内(内置1ml生理盐水)混匀后13500rpm 离心10min,弃上清后，加25ul裂解液充分混匀，100℃10min，13500rpm离心10min。上清液即为基因检测模板液。
1.2.3.2 PCR扩增引物由Primer5设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，adeB引物序列: P1 5′-TACCGGTATTACCTTTGCCGGA-3′, P2：5′-GTCTTTAAGTGTCGTAAAAGCCAC-3′，产物长度约250bp。PCR反应体系为50ul,其中10×缓冲液10ul,25mmol/L MgCl2 4mL,dNTPs(各2.5mmol/L)混悬液1ul， taqDNA聚合酶(5U/μL)0.5ul,dH2O 31ul, 上下游引物（10umol/L）各0.5ul,DNA模板液2.5ul。反应条件：94℃预变性5min,94℃变性30s，52℃复性50s，72℃延伸1min,共30个循环，最后72℃延伸7min，PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶（含EB）电泳检测扩增产物，凝胶置紫外光线下观察结果, 并经凝胶成像系统扫描成像，产物经琼脂糖凝胶电泳出现与目的基因相对分子质量相当的条带为阳性[2]。
2结果
2.1 AB耐药性2011年~2013年我院临床分离AB耐药性见表1。
2.2外排泵adeB基因 PCR擴增结果adeB基因 PCR产物电泳结果见图1，在分子量250 bp大小附近多重耐药组和相对敏感组均可看到一条特异性的条带，铜绿假单胞菌为阴性对照，未见此扩增片段。47株临床分离鲍曼不动杆菌adeB基因阳性率为80.9%，其中，多重耐药组与相对敏感组阳性率分别为89.7%（35/39） 和37.5%（3/8）,差异有统计学意义(χ2为8.572，P<0.05)。（扩增产物通过序列测定和BLAST比对分析,确定为adeB基因部分核苷酸序列。）
图1adeB基因 PCR产物电泳图谱
3讨论
AB是医院感染的重要条件致病菌，在免疫力低下、接受侵袭性操作的患者中,可以引起呼吸机相关肺炎、泌尿系统感染、败血症、脑膜炎和手术伤口感染等严重的甚至致死性的感染。其分离率位居我国临床常见革兰阴性杆菌第3位，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌[3]。
AB的耐药率近年呈不断上升趋势,耐药谱日趋广泛。分析近3年我院临床分离AB的耐药情况，2011年耐药率较低，对大部分抗菌药物较敏感，2012年耐药率出现了大幅度上升，分离出了多株多重耐药，甚至泛耐药菌株，耐药形势非常严峻。AB耐药机制十分复杂,与灭活酶产生、膜蛋白缺失、主动外排泵过度表达以及基因突变有关[4]。多重耐药的菌株一般都会合并几种耐药机制，其中以主动外排系统介导多种抗菌药物的敏感性下降或耐药最为普遍。
主动外排系统广泛存在于革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌及哺乳类细胞中，它可以将底物排出细胞外，从而保护细胞免受毒性生物分子的侵害。细菌的外排泵系统可分5大类：ATP结合盒转运体家族(ATP-binding cassette family, ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily, MFS)、药物与代谢物转运体超家族(the much larger drug/metabolite transporter superfamily, DMT)及与之相关的小多药外排家族(the small multidrug resistance family, SMR)、多药物与毒物外排家族(the multidrug and toxic compound extrusion family, MATE)、耐受-生节-分裂家族(the resistance-nodulation-division family, RND) [5-7]。AdeABC是重要的AB外排泵系统，调控基因为adeR，adeS。比较基因组学研究发现，表现为多药耐药的鲍曼不动杆菌AYE株存在AdeABC外排泵系统，而敏感株SDF株则无该外排泵系统[8]。因此，adeB基因可作为AdeABC外排泵系统的遗传标记。AdeABC外排系统属于RND家族,能够泵出氨基糖苷类、头孢他啶、替加环素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶和喹诺酮类抗菌药物[9]。
本文应用PCR技术在47株临床分离AB中检出主动外排基因adeB阳性38株,阳性率为80.9%,其中，多重耐药组与相对敏感组adeB基因阳性率分别为89.7%（35/39） 和37.5%（3/8）。可见多重耐药菌株的主动外排基因adeB阳性率明显高于相对敏感菌株。提示AdeABC外排泵系统的耐药基因adeB与AB的多重耐药密切相关,由外排泵介导的耐药性在AB多药耐药中发挥了一定的作用。
综上所述,在面对细菌耐药性不断发展的情况下, 合理应用抗菌药物是减少多重耐药的重要措施,AB耐药机制复杂,与灭活酶产生、膜蛋白缺失、主动外排泵过度表达以及基因突变有关。本文通过分析了鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵系统中外排泵基因adeB分布情况，说明了AdeABC主动外排系统在介导AB多重耐药性的形成中具有一定的作用。
参考文献：
[1]钱洁,宋诗铎. OXA－23酶介导的鲍氏不动杆菌对碳青霉烯的耐药机制[J]． 国外医药抗生素分册,2007,28(3):121-123.
[2]Magnet S, Courwalin P, Lanbert T, et al. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumammii strain BM4454[J]. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(12):3375-3380.
[3]朱德妹,汪付,胡付品,等, 2010年中国CHINET细菌耐药性检测[J], 中国感染与化疗杂志,2011,11(5):321-329.
[4]Viveiros M, Martins M, Couto I, et al. New methods for the identification of efflux mediated MDR bacteria, genetic assessment of regulators and efflux pump constituents, characterization of efflux systems and screening for inhibitors of efflux pumps[J]. Curr Drug Targets,2008,9(9):760-781.
[5]王卫华,汪丽,呂婉飞,等. 多药耐药大肠埃希菌抗菌制剂外排泵基因研究[J]. 中华临床感染病杂志,2010,3(5):290-294.
[6]Poole K. Efflux-mediated antimicrobial resistance[J]. J Antimicrobial Chemother,2005,56(1):20-51.
[7]Piddock L J V. Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J]. Clin Microbiol Rev,2006,19(2):382-402.
[8]Fourmier P E, Vallenet D, Barbe V, et al. Comparative genomics of multidrug resistance in Acinetobacter baumannii [J]. PLo S genetics,2006,2(1):e7.
[9]Viveiros M, Martins M, Couto I, et al. New methods for the identification of efflux mediated MDR bacteria, genetic assessment of regulators and efflux pump constituents, characterization of efflux systems and screening for inhibitors of efflux pumps[J]. Curr Drug Targets,2008,9(9):760-781.
编辑/哈涛
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