对照均无扩增，表明重复性好。对186份临床样品应用建立的RPA方法和常规PCR方法同时进行检测，并对其中40份肺脏样品进行支原体的分离鉴定，结果显示分离鉴定出的13份Mo阳性样品及常规PCR法检测出的95份阳性样品经RPA检测，结果均为阳性。【结论】建立的Mo RPA方法特异性强、重复性好，可作为Mo的快速检测和流行病学调查的一项候选技术。
关键词：绵羊肺炎支原体;重组聚合酶扩增;等温扩增
中图分类号：S 852.62文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）04-416-06
Abstract： 【Objective】 To develop a rapid detecting method for Mycoplasma ovipneumoniae （Mo）. 【Method】 Based on the P80 gene sequence， specific primers were designed using Oligo 7 software. Conditions of the recombinase polymerase amplification （RPA） method were optimized for the application. 【Result】 The new assay detected P80 gene in Mo specifically， not any other common pathogens of sheep and goats. The detection sensitivity was 70 fg·μL-1， which was the same as provided by conventional PCR. The inter- and intra-batch tests showed that the modified method could amplify the bands on Mo-positive samples， not on Mo-negative specimens， indicating an acceptable repeatability of the methodology. Furthermore， the RPA assay and conventional PCR methods were simultaneously used on 186 clinic samples， as well as the Mycoplasma isolation and identification on 40 lung samples， to show that the RPA assay positively identified all 13 Mo-positive samples detected by Mycoplasma isolation and identification and 95 positive samples detected by the conventional PCR. 【Conclusion】The newly developed RPA method had desirable specificity and repeatability on Mo detection. It could be applied for rapid detecting and epidemiological studies on Mo.
Key words： Mycoplasma ovipneumoniae; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification
0 引言
【研究意義】绵羊肺炎支原体Mycoplasma ovipneumoniae，Mo属于软膜体纲Mollicutes，支原体目Mycoplasmatales，支原体科Mycoplasmaceae，支原体属Mycoplasma，已被确认为引起绵羊和山羊支原体性肺炎（Mycoplasma pneumonia of goats and sheep，MPGS）的主要病原之一[1-4]。Mo的临床症状表现为气喘、高热、咳嗽、渐进性消瘦和肺间质增生性炎症[5-7]，该病发病率为20%～30%，在急性发病过程中，病死率可达30%～50% [8-9]。近年来，随着养羊业的发展，该病在国内各省市均有流行发生的报道，给养羊业造成了巨大的经济损失，已成为制约养羊业健康发展的重要疫病之一[10-12]。因此，建立一种快速简便的检测技术对于该病的防控与及时治疗具有重要意义。
【前人研究进展】PCR技术在检测病原体的方法中，被认为优于分离培养法、免疫荧光检测法和ELISA法等，以其能够检测微量的病原DNA而被作为诊断多种疫病的常用方法[13]。然而PCR反应需要特殊的热循环设备，很多基层单位不具备检测条件。重组聚合酶扩增 （Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术 （英国公司TwistDxInc研发）主要依赖于3种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶，模拟生物体内DNA复制，在常温反应0.5 h左右即可完成对目的片段的扩增，操作简单，尤其适用于基层使用[14]。目前，RPA技术已经在病毒、支原体、衣原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了广泛开发与应用，如口蹄疫病毒[15]、非洲猪瘟[16]、山羊支原体山羊亚种[17]、动物衣原体[18]、结核分枝杆菌[19]、疟原虫[20]等。【本研究切入点】迄今为止，尚未见RPA技术应用于Mo的检测。P80基因编码的膜蛋白在免疫特性方面虽未有深入研究，但已应用于遗传进化树分析，且以该基因为靶基因建立的诊断方法已有常规PCR和荧光定量PCR方法[9，21]。【拟解决的关键问题】本研究根据Mo膜蛋白P80基因序列，利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性的扩增引物，建立Mo快速简便的检测方法，为基层工作者在Mo临床样品的快速检测和流行病学调查提供一种新的技术支持。
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