摘要：基因组DNA碱基的转换/颠换、插入/缺失及重排等变化会导致生物个体之间的差异，这种变化可能是发生在编码区、非编码区、内切酶识别序列、启动子、调控序列等，由此产生了各类分子标记技术。笔者基于分子标记研究，从基因组碱基序列变化角度对各类分子标记产生的根源及引物设计等方面内容进行综述，以期为更好掌握和运用分子标记提供参考。
关键词：核苷酸；序列；差异；分子标记；引物设计
中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0047-05
收稿日期：2013-09-06
基金项目：陕西省农业科技创新项目（编号：NKC01-01）。
作者简介：张羽（1968—），女，陕西汉中人，硕士，副教授，从事遗传学理论与实践等教学和科研工作。E-mail：zy68169@sina.com。生物的遗传信息都蕴藏在碱基序列中，基因组碱基的转换、颠换以及插入、缺失等变化会导致个体与个体之间的差异，即表现出生物的遗传多样性，这种特性既能传递又能以多种形式表现出来，这就是通常所说的遗传标记。遗传标记具有可遗传性和可识别性，人们可以通过追踪生物的性状、染色体、染色体某一片段、蛋白质或DNA序列在家系中传递的规律和变化来研究生物的遗传变异。因此，这种遗传特性可以通过形态学、细胞学、生化及分子水平上的差异来表现，也就是说生物任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。DNA 分子标记是以DNA分子的多态性为基础的遗传标记，它反映了生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段。与其他标记相比，DNA分子标记具有无可比拟的优越性：直接以DNA形式表现，既不受环境影响，也不受生物组织、发育时期影响；标记的数量多、多态性高；表现为中性，不影响目标性状的表达；许多标记表现为共显性，能区别纯合体和杂合体；成本不太高等。目前主要有基于分子杂交的DNA标记技术和基于PCR的分子标记技术两大类，基于分子杂交的DNA标记技术主要有限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）、可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）、原位杂交（in situ hybridization，ISH）等；以PCR为核心的分子标记技术主要有随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等。
1第1代分子标记技术
1.1RFLP技术
1974年，RFLP技术第1次被用于遗传分析[1-2]，它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第1代遗传标记，是最早的DNA标记技术。RFLP技术的依据是限制性酶切位点上碱基的缺失/插入、重排和点突变而导致的基因型之间的限制性片段长度差异，利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA。由于碱基组成不同，得到大小不等的酶切DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况，再通过凝胶电泳形成不同带型，最后用经标记的相应DNA探针与这些片段进行杂交，通过放射自显影而显示出的图谱就可以反映出不同个体基因组DNA序列之间的差异。如图1所示，个体a1、个体a2的基因组序列中有EcoRⅠ位点，但是由于碱基的插入/缺失，导致各自的EcoRⅠ酶切位点的位置不同。通过EcoRⅠ酶切后，个体a2除了形成与个体a1相同长度的片段外，还有一个长度不一的片段（比个体a1长约15 bp的片段）；由于个体a3在EcoRⅠ位点发生点突变，EcoRⅠ的酶切序列GAATTC变成了BamHⅠ的酶切序列GGATCC，因此用EcoRⅠ酶切，则产生不了片段，但用BamHⅠ酶切，个体a3出现条带，而个体a1和个体a2不出现条带。RFLP具有数目多、共显性、不受环境影响、多态性高等特点，但RFLP技术对样品要求高，DNA 必需是大分子，因此在抽提DNA过程中要避免DNA断裂，限制性内切酶酶切消化要彻底；此外，制作杂交探针较困难，试验操作较繁锁，检测周期长，成本费用高。
1.2VNTR技术
VNTR别称小卫星DNA（minisatellite DNA），真核生物基因组中有2类可变的串联重复序列，根据核心序列（重复序列）的长度分为小卫星和微卫星，其中小卫星重复单位的核心序列为15到几十甚至几百个核苷酸，一般位于基因组高变区，是基因组中的重组热点，拷贝数达数百次不等，呈现出丰富的长度多态性[3-4]。VNTR技术的原理与RFLP技术大致相同，首先选择在VNTR特异序列上的无酶切位点（保证小卫星序列的完整性）的限制性内切酶将总基因组DNA切成不同长度的片段，然后以VNTR中的特异序列为探针进行Southern杂交，放射自显影后就可检测到很多小卫星位点。如图2所示，小卫星重复单位的核心序列为GGAGGTGGGCAGGAGG，在个体b1中核心序列重复了8次，记为（GGAGGTGGGCAGGAGG）8；个体b2中重复了7次，记为（GGAGGTGGGCAGGAGG）7；个体b3中核心序列重复了10次，记为（GGAGGTGGGCAGGAGG）10。因此，用VNTR标记就会形成3个不同长度的多态性，其中个体b2的扩增片段最短，个体b1比个体b2扩增片段长约16 bp的片段，个体b3比个体b2扩增出长约48 bp的片段。由此可以看出，VNTR数量有限，在基因组上分布不均匀；同时，VNTR技术具有试验操作繁琐、检测时间长、成本高等缺点。
2第2代DNA分子标记技术
2.1RAPD技术
1990 年，Welsh等第1次提出RAPD[5-6]。RAPD技术是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物而进行的PCR 扩增技术。RAPD技术通常使用10个左右碱基的随机单链引物，由于基因组中存在很多反向序列，因此RAPD扩增的是正向序列和反向序列之间的片段，引物在DNA模板上有很多结合位点，只有当2个引物结合位点较近且方向相反时，扩增才能进行。如果2个引物结合点彼此背离，扩增不会发生；引物结合点在相同的方向，扩增也不会发生；引物之间彼此相隔太远（>2 000 bp），扩增也不会发生。引物结合位点DNA序列的改变可能导致引物无法与模板结合，从而扩增无法进行或扩增片段数目改变。2个扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入等导致扩增片段数目和长度的差异。如图3所示，用10 bp的随机引物GCTGCTATCT进行扩增，个体c1将得到扩增长度约111 bp的片段，个体c2将得到扩增长度约74 bp的片段，个体c3由于发生点突变，引物无法与模板配对，因此扩增不出片段。RAPD 技术由于不涉及分子杂交和放射性自显影技术，引物为完全随机引物，因此设计引物时无须知道模板序列信息。RAPD 技术具有引物成本较低、DNA需要量少、技术简便、操作方便、快速、引物通用等特点。但RAPD大多为显性遗传，不能鉴别显性纯合子和杂合子；RAPD技术的试验重复性较差，结果可靠性较低。
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