材料与方法
1.1试剂
Keap1抗体、Nrf2抗体、HO-1抗体均购自大连宝生物公司，ABC试剂盒购自武汉博士德生物公司，DAB购自 Sigma公司（美国），动物切片石蜡（熔点为60～62 ℃）、多聚甲醛购自上海凌锋化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验动物处理
采用28只9～11周龄、体质量200～220 g的雄性SD大鼠作为试验动物，购自江苏大学试验动物中心。试验前对大鼠饥饿处理24 h，然后采取束缚处理并浸泡于（20±2）℃的水中，水位达到大鼠剑突部[9]。分别于应激后7 h、恢复3 d、恢复7 d时采样。采用乙醚麻醉，颈椎脱臼致死。
1.3溃疡指数的测定
剖腹将胃取出，结扎贲门和幽门，从腺胃部注入10 mL 1%多聚甲醛，并将全胃放入1%多聚甲醛溶液中浸泡 10 min；沿胃大弯将胃剪开，用生理盐水轻轻冲洗胃黏膜面，按Guth标准评估胃黏膜损伤UI，并按以下标准累计积分[10]。按黏膜溃疡或糜烂长度（mm）计算，斑点状糜烂为1分；糜烂长度不足1 mm为2分，介于1～2 mm为3分，2～4 mm为4分，超过4 mm为5分；糜烂宽度超过1 mm则分值加倍。全胃得分之和为胃溃疡指数。
1.4样品处理与免疫组织化学
选取病变及与其交界处胃壁全层的胃组织，采用石蜡切片法制作成厚度为7 μm的切片，将切片进行免疫组织化学染色，观察胃黏膜组织HO-1、Keap1、Nrf2的定位与表达。
1.5免疫组织化学阳性结果的判定
Keap1、Nrf2、HO-1蛋白阳性表达时，经免疫组织化学染色着色呈棕褐色。对上述结果采用双评分半定量法进行统计，在显微镜下随机观察5个高倍镜视野，每个视野计数的细胞≥1 000个，并统计阳性细胞的平均百分比，以此作为评分标准。具体评分方法为：无阳性细胞为0分，阳性细胞占0～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。以染色程度作为评分标准，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将以上2种评分结果相加，作为该切片的表达强弱得分。每只大鼠选取10张切片，计算每组的平均得分。整个计数及评分过程均由2位经验丰富的病理医师协助完成。
1.6统计学分析
所有数据均以“平均值±标准误”（x[TX-*5]±s）表示，所有试验均重复4次以上。采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行处理，经单因素方差分析（ANOVA），差异显著性检验采用Turkey检验法进行多重比较。
2结果与分析
2.1WRS处理对大鼠胃黏膜UI的影响
由图1可知，WRS处理7 h后，大鼠胃黏膜出现点线状溃疡出血和少量血凝块，UI为39.7±6.8；恢复3 d时UI为 30.6±6.1，与WRS 7 h组相比差异不显著（P>0.05）；恢复 7 d 时UI为10.4±5.0，显著低于WRS 7 h组和恢复3 d组（P<0.05）。
2.2免疫组织化学检测Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的定位
由图2可知，WRS处理前后，Keap1（图2-A）、Nrf2（图2-B）、HO-1（图2-C）3种蛋白均主要定位于大鼠胃底腺细胞胞质中，其中Nrf2在溃疡周围胃底腺细胞胞核中也有表达。
2.3Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达水平
[CM（24]由图3可知，WRS处理7[KG*3]h后，Keap1表达量显著降低[CM）]
[FK（W12][TPHP1.tif]
[FK（W19][TPHP2.tif]
（P<0.05），7 d后恢复至正常水平。WRS处理7 h后，Nrf2表达量无显著变化，但恢复3 d后其表达量显著升高（P<0.05）；与恢复3 d组相比，恢复7 d时Nrf2表达量出现下降（P<0.05），但仍显著高于正常水平（P<0.05）。WRS处理7 h后，HO-1表达量显著升高（P<0.05），3 d后恢复至正常水平。
[TPHP3.tif]
3结论与讨论
WRS处理大鼠被广泛应用于应激性胃溃疡病理机制的研究，具有简单、高效、重复性高等特点，是理想的试验动物模型。本试验中，WRS处理7 h后，大鼠胃黏膜出现明显的溃疡病变，表明应激性胃溃疡模型建立成功。
动物受到环境应激后，SNS、HPA敏感性升高，肾上腺素、糖皮质激素、儿茶酚胺等激素的分泌增加，诱导氧自由基大量產生，导致细胞膜内脂质过氧化物的生成，引起氧化应激。大量研究表明，Keap1/Nrf2/HO-1信号通路在细胞抗氧化损伤和炎症损伤等过程中发挥重要作用[5]。其中，核转录因子Nrf2属于CNC-bZIP（cap‘n’collar subfamily of basic leucine-zipper），即CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族，能够诱导一系列抗氧化剂保护蛋白的编码，参与调节抗氧化应激反应，是CNC家族成员中最强的转录因子[11]。大量研究表明Nrf2与多种疾病的发生有关[11-15]。很多因素可影响Nrf2的表达。Keap1是一种E3泛素连接酶，在胞浆中锚定于肌动蛋白，可调节Nrf2的泛素化过程，是氧化应激反应的主调节器[13]。生理状态下，Nrf2与Keap1偶联被锚定在胞浆中，Nrf2被泛素化修饰并快速降解，从而维持细胞基础的氧化还原平衡；当细胞暴露于氧自由基时，Keap1的构象发生改变，Nrf2从二聚体上解离并转移进入细胞核，调控下游抗氧化基因HO-1等表达，清除多余的氧自由基，从而发挥抗应激作用[6，13]。通过免疫组织化学检测发现，WRS处理前后，Keap1和Nrf2均主要定位于大鼠胃底腺细胞胞质中，其中Nrf2在胃溃疡组织周围胃底腺细胞胞核中也有表达。蛋白表达半定量分析发现，WRS处理7 h后，Keap1表达量明显下降，Nrf2在恢复3 d后表达量显著升高。提示WRS处理可能导致大鼠胃底腺细胞胞质中的Nrf2从二聚体解离，并转移进入细胞核，从而起到了抗应激作用。
HO-1为诱导性血红素加氧酶，别称热体克蛋白32，很多诱导因素均可引起其活性及蛋白量增加。已有研究证实，HO-1作为一种应激蛋白，在应激和疾病条件下对消化道具有抗炎、抗组织损伤、抗氧化、保护细胞黏膜、调节胃肠运动等积极作用。目前已从动物和人的组织器官中分离纯化出3种血红素氧合酶（HO）的同工酶，HO-1为诱导型，HO-2、HO-3 为结构型[16]。生理状态下，消化道中的HO同工酶主要为HO-2，而HO-1在肠组织中不表达，仅在缺血、缺氧等刺激下才开始分泌HO-1。在消化道疾病中，HO-1的水平增加，发挥抗炎、抗氧化等细胞保护作用[17]。沈锡中在乙酸诱导的大鼠胃溃疡模型中发现，HO-1蛋白定位于胃黏膜细胞中，胃溃疡大鼠的胃黏膜HO-1基因表达水平显著高于正常大鼠[8]。本试验通过免疫组织化学检测发现，WRS处理前后，HO-1均主要定位于大鼠胃底腺细胞胞质中；蛋白表达半定量分析发现，WRS处理7 h后，HO-1表达量出现明显升高的现象。提示应激性胃溃疡发生后，HO-1可能参与了胃黏膜抗损伤机制。
在应激性胃溃疡的发生及发展过程中，Keap1、Nrf2、HO-1出现了表达量和蛋白定位的改变，表明这3种蛋白可能均参与了胃黏膜的抗氧化损伤机制。由于调控Nrf2和 HO-1的信号通路非常多，Keap1/Nrf2/HO-1信号通路在应激性胃溃疡中的作用机制有待进一步验证。
[HS2*5][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]
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