摘要：【目的】建立和优化固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（简称菌株WZS021，下同）的接合转移体系，以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术。【方法】以大肠杆菌Escherichia coli ET12567（pUZ8002）为供体菌，携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌，进行菌株WZS021接合转移。【结果】选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基，50 ℃热激10 min，供受比为1∶10，涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素，添加MgCl2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高，达3.24×10-6。【结论】通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系，有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。
关键词： 固氮链霉菌WZS021；接合转移；优化；pSET152
中圖分类号： Q939.113 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0581-06
Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish and optimize transconjugation system of Streptomyces chartreusis WZS021（hereinafter referred to as strain WZS021），in order to eich strain WZS021 gene fragment transfer technology. 【Method】As donor strain，Escherichia coli ET12567（pUZ8002） contained integrative plasmid pSET152. Strain WZS021 was recipient. Transconjugation was conducted on strain WZS021. 【Result】The optimal conditions were as follows：Gauze’s medium No.1 as the transconjugation medium， heat shock at 50 ℃ for 10 min， donor-recipient ratio 1∶10，20.0 mg/L apramycin coverage 12 h post transconjugation， and adding MgCl2 till final concentration of 5.0 mmol/L. Under these conditions，the transconjugation efficiency was the highest， which was up to 3.24×10-6. 【Conclusion】The suitable transconjugation conditions for strain WZS021 are ascertained， and an effective genetic transformation system for strain WZS021 is established based on it. It is helpful to insert marker genes to detect nitrogen fixation sites of the strain and exogenous gene transfer.
Key words： Streptomyces chartreusi WZS021； transconjugation； optimization； pSET152
0 引言
【研究意义】固氮微生物是近年来生物固氮研究的热点，有效利用固氮微生物可减少化肥使用量，改善土壤和生态环境质量，提高农作物产量和品质，有利于农业结构调整，提高经济效益、生态效益和社会效益（李杨瑞，2010；李剑锋等，2015）。链霉菌是一种放线菌，全世界约2/3的抗生素产自该菌属（莫宏波等，2004），在医学和农业等领域均有突出地位。固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（简称菌株WZS021，下同）是一株具有高固氮能力的链霉菌（Wang et al.，2016），目前对该菌种接合转移研究方面鲜有报道，其接合转移的具体条件尚不清楚。因此，掌握固氮微生物的生物技术，建立并优化固氮链霉菌S. chartreusi WZS021的接合转移体系，对今后开展菌株WZS021在农业上的应用研究具有重要意义。【前人研究进展】链霉菌的遗传转化主要采用原生质体转化法、接合转移法和电转化法等（Veal et al.，1992；Christensen et al.，1996；吴胜和夏焕章，2002）。赫卫清和王以光（2006）研究发现，链霉菌高度分化，遗传背景复杂，不同菌株的接合转移条件不完全相同。王航等（2014）研究表明，接合转移法以其操作程序简单、时间成本小、转化效率可观和能使外源DNA避开胞外核酸酶降解等优点成为链霉菌转化的主要遗传技术。【本研究切入点】前人对链霉菌属的接合转移研究主要集中在抗生素产生菌上，如产雷帕霉素的吸水链霉菌NRRL5491（杨旻和陶美凤，2007）、产放线紫红素的阿维链霉菌NRRL8165（余姣姣和陶美凤，2010）和产达托霉素的玫瑰孢链霉菌NRRL11379（王航等，2014）等，而关于固氮功能型链霉菌遗传转化体系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在不同培养基、热激温度、供受比、抗生素使用浓度和时间及Mg+浓度等条件下对菌株WZS021的接合转移系统进行优化，以期获得高效、便捷的接合转移方法，以丰富菌株WZS021的基因片段转移技术。
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