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摘要：研究了不同质量浓度（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）的吡咯喹啉醌（PQQ）对水芹种子萌发过程的影响，结果表明：在PQQ的作用下，水芹种子的发芽率、发芽势、发芽指数和呼吸强度均随着PQQ质量浓度的增加而提高，其中质量浓度为16 μg/mL的PQQ浸种效果最佳，PQQ具有促进水芹种子萌发的生理效应;PQQ的作用对水芹种子中淀粉酶活力影响不大，对脂肪酶和过氧化物酶活力有着明显的增强作用.
Abstract：The effects of pyrroloquinoline quinone （PQQ） at different mass concentrations （4 μg/mL， 8 μg/mL， 12 μg/mL and 16 μg/mL） on the germination process of cress seeds were studied. The results showed that the germination rate， the germination potential， the germination index and the respiration rate of cress seeds increased with PQQ’s concentration. The PQQ had the best seed soaking effect when the concentration was 16 μg/mL. The PQQ could promote the germination of cress seeds. The PQQ had little effect on the amylase activity in cress seeds， and it had a significant enhancement effect on lipase and peroxidase enzyme activities.
关键词：吡咯喹啉醌;水芹;种子萌发;生理效应
Key words：pyrroloquinoline quinone;cress;seed germination;physiological effect
中图分类号：Q569;TS255.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.04.001
文章编号：2096-1553（2019）04-0001-07
0 引言
1960年代，一种新型维生素吡咯喹啉醌PQQ（pyrroloquinoline quinone）被科学家发现，它广泛存在于水果、蔬菜、谷物等食品中，是許多细菌中甲醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶GDH（glucosedehydrogenase）、甘油脱氢酶等的辅酶，能够参与呼吸链电子传递[1-2].但是，只有部分革兰氏阴性菌能够自身合成PQQ，而人类与动植物主要从外界获取该维生素[3-4].
研究表明，PQQ可以缩短植物生长停滞期，促进植物细胞新陈代谢和生长[5].
张鹏等[6]研究发现，在小麦植株生理代谢调节过程中，PQQ可增加叶绿素含量，使光合速率增加，并提高硝酸还原酶和谷氨转氨酶活性，从而减少穗部小花败育，提高小麦结实率.
匡炜等[7]的研究表明，PQQ能有效提高湘早籼45号水稻的每穗实粒数和结实率，减少每穗空粒数，对水稻增产有促进作用.另外，PQQ作为GDH
的氧化还原辅因子，可将葡萄糖转化为葡萄糖酸，溶解不溶性磷酸盐到土壤中，促进植物吸收生长[8].PQQ还可以促进玫瑰红苹果和红富士苹果花粉萌发和花粉管生长，但浓度过高则会减弱效果，甚至产生抑制效应，且红富士苹果较玫瑰红苹果更为敏感，当PQQ浓度高于1 μmol/L时即产生明显的抑制效应[9].
总之，PQQ能促进某些植物生长，但其对水芹种子的萌发过程是否有影响尚不明确.本文拟以水芹种子为原料，研究不同质量浓度的PQQ对水芹种子萌发的影响，并进一步研究PQQ的作用对种子萌发过程中关键酶（淀粉酶、脂肪酶和过氧化物酶）活性的影响，以明晰PQQ对水芹种子萌发的生理效应和作用机制.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验材料：水芹种子，购于郑州市种子公司;吡咯喹啉醌（色谱纯），由瀚香生物科技公司提供.
实验试剂：3，5-二硝基水杨酸、甲苯、乙醇，天津市致远化学试剂有限公司产;愈创木酚，北京索莱宝科技有限公司产;橄榄油、乙醚，生工生物工程上海股份有限公司产;百里香酚酞，广东光华化学厂有限公司产.以上试剂均为分析纯.
1.2 仪器与设备
HH-S型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗器械有限公司产;SHP-250型恒温光照培养箱，上海鸿都电子科技有限公司产;2300型UV-分光光度计，尤尼克（上海）有限公司产;Sartorius PB-10型pH酸度计，上海市实验仪器总厂产.
1.3 实验方法
1.3.1 水芹种子萌发
取大小均匀的水芹种子，将其分为5组，每组20粒.用质量分数1%的NaClO浸种20 min，蒸馏水洗净，再用不同质量浓度的PQQ（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）室温浸种48 h，用3 mL不同质量浓度的PQQ溶液浸润滤纸，并将种子点播吸附在滤纸上，置于恒温培养箱中于25 ℃下光照培养.其间补加相应质量浓度的PQQ以保持滤纸的湿润[10].实验持续5 d，每d记录正常发芽种子数.按以下公式计算水芹种子的各种活力指标.
发芽率=种子发芽数供实验种子数×100%
1.3.2 呼吸强度测定
呼吸强度，是植物体新陈代谢强弱的一个重要指标，它是指单位面积或单位质量的植物体，在单位时间内所吸收的O2或释放的CO2量或损失的干重.
用饱和碱液吸收一定量的植物材料在单位时间内放出的CO2，再用标准酸液滴定，即能测得植物的呼吸强度.
参照李海霞等[11]的方法，用上述不同质量浓度的PQQ对种子进行浸种处理，实验持续 5 d，每d对呼吸速率进行测定，然后按以下公式计算呼吸强度.
其中，V0为空白滴定用去的草酸量/mL，V1为样品滴定用去的草酸量/mL，W为样品鲜重/g，T为测定时间/h.
1.3.3 酶活力测定
1.3.3.1 淀粉酶活力测定
参照张志鹏[12]的方法，采用3，5-二硝基水杨酸还原法，每12 h对不同质量浓度PQQ浸种处理的水芹种子中淀粉酶活性进行测定，实验持续3 d。酶活力定义为每g样品在单位时间内生成还原糖（麦芽糖）的量.
麦芽糖标准曲线的制作：分别配制0 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL 和1.0 mg/mL的麦芽糖标准溶液，吸取标准溶液1.0 mL于刻度试管中，加3.0 mL 二硝基水杨酸（DNS）试剂，摇匀，沸水浴10 min后经流水冷却，加蒸馏水定容至15 mL，在520 nm 的波长下比色测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖质量浓度的回归方程.
淀粉酶液制备：称取1 g经不同质量浓度PQQ溶液作用的水芹种子于研钵中，加入5 mL蒸馏水，研磨匀浆后倒入离心管中，再用10 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管.在室温下静置 20 min 制备提取液，每隔5 min搅动1次，使其充分提取.在4 ℃条件下3000 r/min低温离心10 min，取上清液加蒸馏水定容至100 mL后摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定.取淀粉酶原液10 mL，用蒸馏水定容至 50 mL 后摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶活力的测定.
1.3.3.2 脂肪酶活力测定
脂肪酶可以分解种子中贮藏的营养物质，为种子萌发的异养阶段提供能量[13].
参照GB/T 5523—2008[14]，称取2 g水芹种子于研钵中，加入1.0 mL橄榄油，混匀，加入5.0 mL pH=7.5的磷酸缓冲液，研磨后转入100 mL锥形瓶中，用5.0 mL蒸馏水洗净研钵，洗液全部转入锥形瓶中，加3滴甲苯，置于30 ℃恒温箱内，保温24 h后取出.加入V（乙醇）GA6FAV（乙醚）=4GA6FA1的混合液50 mL，静置5 min，加入0.5 mL质量分数为1%的百里香酚酞乙醇溶液指示剂，用0.2 mol/L氢氧化钠乙醇溶液滴定至终点（浅蓝色），记录用去碱液的体积（V2）.另外称取2 g相应质量浓度试样做对照试验，除不用 30 ℃ 保温24 h外，其余操作同上，记下用去的碱液体积（V3）.
每12 h对不同质量浓度PQQ作用的水芹种子进行脂肪酶活性测定，实验持续 3 d.
其中，V2为试样滴定用去的碱液体积/mL，V3为对照试验用去的碱液体积/mL，N为实际碱液质量浓度/（mol·L-1），W1为试样质量/g，M为试样水分质量分数/%.
1.3.3.3 过氧化物酶活力测定
过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，与呼吸作用、光合作用、生长素的氧化等都有关系[15].
分别取0.5 g经不同质量浓度PQQ作用的水芹种子于研钵中，加入液氮后充分研磨，再加入3.0 mL磷酸缓冲液，预冷5 min，7000 r/min 离心15 min，上清液为粗酶提取液，提取后低温保存待用.
酶活力测定的反应体系为：0.05 mol/L磷酸缓冲液2.9 mL;2%的H2O2 1.0 mL;0.05 mol/L 愈创木酚 1.0 mL;酶液0.1 mL.用加热煮沸5 min的酶液作为对照.反应体系加入酶液后，立即于34 ℃水浴保温30 s，在 470 nm 波长处进行比色，开始记录数据，然后每 0.5 min 记录一次吸光度值，共测2 min.
以每min A470的变化值0.01为一个相对酶活单位U，计算植物组织内过氧化物酶活力的大小.每12 h对经不同质量浓度PQQ作用的水芹种子进行过氧化物酶活力测定，实验持续3 d.
其中，Vt为酶液的总体积/mL，ΔA470为吸光度的变化值，t为间隔时间/min，Vs为测定时取用的酶液体积/mL，W2为粒种子的质量/g.
2 结果与分析
2.1 不同质量浓度的PQQ对水芹种子萌发的影响
水芹种子萌发实验结果如图1所示.由图1可知，以胚根突破种皮1 mm作为种子发芽标准（图1a）），萌发初期（即培养期的前96 h）组间差异不明显，水芹种子基本不发芽或者刚刚露白（图1b））.图2为中后期水芹种子萌发情况.由图2可知，在4种质量浓度范围内，PQQ质量浓度越高，对种子萌发的促进作用越明顯.在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下，种子萌发到120 h时的发芽率为43.4%，对照组发芽率为33%;至192 h时的发芽率提升至85%，对照组发芽率为42.6%.在其他3种质量浓度的PQQ作用下的水芹种子的发芽率均高于对照组，低于在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下的发芽率.由此可见PQQ能有效促进水芹种子的萌发.
在不同质量浓度的PQQ作用下水芹种子的发芽指数、发芽率和发芽势如图3和图4所示.由图3和图4可知，水芹种子在萌发的第 8 d，对照组的发芽率为56.7%，在质量浓度为 8 μg/mL 的PQQ作用下的种子发芽率为70%;在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下的种子发芽率最高，为86.7%.以萌发第5 d计算发芽势，在质量浓度为0～16 μg/mL的PQQ作用下，种子的发芽势从33.3%提高到43.3%.这表明随着PQQ质量浓度的提高，水芹种子发芽势逐渐增大，种子活力提高，发芽率随之提高.
2.2 不同质量浓度的PQQ对水芹种子呼吸强度的影响
在不同质量浓度的PQQ作用下水芹种子的呼吸强度如图5所示.由图5可知，在不同质量浓度的PQQ作用下的水芹种子呼吸强度变化趋势基本一致，表明浸种过程中水芹种子的生理变化正常.在不同质量浓度的PQQ作用下的水芹种子，其萌发过程中呼吸强度始终高于对照组，其中经质量浓度为16 μg/mL 的PQQ作用的种子呼吸强度在各个时间段均最高.在水芹种子萌发 120 h 后，经质量浓度为 0～16 μg/mL 的PQQ作用的种子呼吸强度由 0.347 mL·g-1·h-1 提升到 0.400 mL·g-1·h-1.
2.3 不同质量浓度的PQQ对水芹种子关键酶活性的影响
2.3.1 不同质量浓度的PQQ对水芹种子淀粉酶活力的影响
通过测定不同质量浓度的麦芽糖溶液在 520 nm 波长下的吸光度值，建立的回归方程为y=0.834 1x+0.020 4，相关系数R2=0.999.所得麦芽糖标准曲线见图6.
在不同质量浓度的PQQ作用下的水芹种子淀粉酶活力如图7所示.
由图7可知，水芹种子经过不同质量浓度的PQQ作用后，其淀粉酶活力变化不大且无明显差异，不同质量浓度在不同时期的测定结果也无显著差异，淀粉酶活力在152.1～161.0 mg·g-1·min-1之间，表明PQQ对水芹种子淀粉酶活力影响不大.
2.3.2 不同质量浓度的PQQ对水芹种子脂肪酶活力的影响
在不同质量浓度的PQQ作用下水芹种子脂肪酶活力如图8所示.由图8可知，经不同质量浓度的PQQ的作用，水芹种子随着萌发进程的推进，脂肪酶活力与对照组有较大的差异，且随着PQQ质量浓度的增加，促进作用更加明显.
经质量浓度为16 μg/mL的 PQQ作用的水芹种子，在种子萌发的第 36 h，其脂肪酶活力为0.71 mol/g，对照组脂肪酶活力为0.4 mol/g;在第60 h，其脂肪酶活力为0.9 mol/g，对照组脂肪酶活力为0.6 mol/g;在第72 h，其脂肪酶活力为0.85 mol/g，对照组脂肪酶活力为0.35 mol/g.
在质量浓度4 μg/mL，8 μg/mL的PQQ作用下脂肪酶活力变化与在质量浓度16 μg/mL的PQQ作用下的趋势相同，且均低于在质量浓度16 μg/mL的PQQ作用下的种子脂肪酶活力.不同质量浓度的PQQ作用下的种子酶活力比对照组均有明显提升，表明PQQ能促进水芹种子脂肪酶活力的增强.
2.3.3 不同质量浓度的PQQ对水芹种子过氧化物酶活力的影响
在不同质量浓度的PQQ作用下水芹种子过氧化物酶活力如图9所示.由图9可知，经过不同质量浓度的PQQ作用后，水芹种子的过氧化物酶活力均有所提高.
经质量浓度为16 μg/mL 的PQQ作用的水芹种子，在种子萌发的第24 h，其过氧化物酶活力为7.2 U，而对照组过氧化物酶活力为5.2 U;在24～48 h过程中，其过氧化物酶活力迅速变大，至48 h时，其过氧化物酶活力为11.3 U，而对照组过氧化物酶活力为4.4 U;
48 h后酶活力提升减缓，经其他质量浓度的PQQ处理的种子过氧化物酶活力变化趋势也基本相同.其原因可能是PQQ能够参与呼吸链电子传递，由此促进了过氧化物酶活力的提高，进而加快了水芹种子萌发.
3 结论
本文研究了4种质量浓度（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）的PQQ对水芹种子萌发过程中发芽率、发芽势、发芽指数、呼吸强度和关键酶（淀粉酶、脂肪酶和过氧化物酶）活力的影响.结果表明，PQQ可以促进水芹种子萌发，种子发芽率、发芽势、发芽指数和呼吸强度均随着PQQ质量浓度的增加而提高，其中，质量浓度为16 μg/mL 的PQQ浸种效果最佳;PQQ对水芹种子中淀粉酶活力影响不大，对脂肪酶和过氧化物酶活力有着明显的增强作用，表明PQQ促进水芹种子萌发的机制可能是通过增强水芹种子萌发过程中脂肪酶和过氧化物酶活力而实现的.
该研究初步探索了PQQ对水芹种子萌发的生理效应，证实了PQQ的作用可以促进水芹种子的萌发，接下来仍需就PQQ提高水芹种子关键酶活力的影响途径作进一步研究，以期为开发PQQ成为生物复合肥中的功能组分提供理论参考.
参考文献：
[1] 章芸，杨修亮，司振军，等.海洋甲基营养菌产吡咯喹啉醌（PQQ）的发酵条件优化及产物分离[J].食品科技，2015，40（8）：2.
[2] 李红月，曾伟主，周景文.高产吡咯喹啉醌扭脱甲基杆菌的高通量选育[J].生物工程学报，2018，34（5）：794.
[3] 彭乔木，周璐璐，熊力，等.嗜甲基细菌Serratia Marcescens NH8的筛选及其PQQ基因的克隆[J].吉首大學学报（自然科学版），2018，39（1）：59.
[4] 冷春玲，宋洁.吡咯喹啉醌生物学功能研究进展[J].辽东学院学报（自然科学版），2014，21（2）：103.
[5] 刘卫群，杨铁钊，李文，等.吡咯喹啉醌对烟草幼苗中IAA和玉米素加玉米素核苷及核酸含量的影响（简报）[J].植物生理学通讯，1998，34（4）：259.
[6] 张鹏，孙慧玲，孙静娴，等.吡咯喹啉醌（PQQ）营养作用研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（10）：1987.
[7] 匡炜，刘洋，李强，等.PQQ对水稻产量及主要农艺性状的影响[J].湖南农业科学，2017，44（12）：40.
[8] HAN S H，KIM C H，LEE J H，et al.Inactivation of PQQ genes of Enterobacter intermedium 60＼"2G reduces antifungal activity and induction of systemic resistance [J].Fems Microbiology Letters，2010，282 （1）：140.
[9] 卫秀英，李秀菊，朱坤华.吡咯喹啉醌对苹果花粉萌发和花粉管生长的影响（简报）[J].植物生理学通讯，2000，36（4）：320.
[10]李良俊，王建锋，印荔，等.水芹新品种及配套优质高产栽培技术[J].长江蔬菜，2013，14（18）：179.
[11]李海霞，徐久玮，蔡明历，等.小篮子法测定植物种子呼吸速率的方法改进[J].生物学杂志，2015，32（1）：100.
[12]张志鹏.水芹种子萌发的因素及其休眠生理研究[D].合肥：安徽农业大学，2007.
[13]唐靓，张岭，李林子，等.吡咯喹啉醌研究新进展[J].食品科学，2015，36（19）：287.
[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.粮油检验 粮食、油料的脂肪酶活动度的测定：GB/T 5523—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[15]杨璐，熊向华，汪建华，等.吡咯喹啉醌研究进展[J].生物技术通讯，2009，20（6）：874.
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