摘 要：以菠萝lAnanas comasus (L)Merr.非胚性愈伤组织为材料，利用离体培养及组织细胞学等方法研究了其在增殖、分化过程中的特性和再生规律。在增殖培养基上经过3次以上继代培养后，非胚性愈伤组织形态上逐渐表现出一定差异。根据其形态结构、分化能力和组织细胞学特征，可把非胚性愈伤组织分为节瘤状组织、薄壁组织团、致密深层愈伤组织和表面疏松愈伤组织4种类型；在增殖培养基Ms+3.0m/LBA+2.0m/LNAA上，一种类型的非胚性愈伤组织通常只会生长出同类型的非胚性愈伤组织，但通过改变培养基配方等方法可使不同类型之间发生转换。同时，增殖继代过程中的器官发生现象很常见，通常是在薄壁愈伤组织表面细胞分化成具有分生能力的细胞，然后进行不定芽的分化。4类非胚性愈伤组织都可以通过拟原球茎、多芽体以及不定芽的形式进行器官发生；也可以经胚性诱导由体细胞胚发生途径再生成植株。其中拟原球茎产生体细胞胚的能力最强，多芽体其次。生长素及细胞分裂素对非胚性愈伤组织的形态结构、分化途径以及增殖能力有很大的影响。
关键词：菠萝；非胚性愈伤组织；类型；形态发生
中图分类号：S668-3 文献标识码：A 文章编号：1009—9980(2008)Ol一65一04
菠萝离体培养中所产生的愈伤组织有2类。一类愈伤组织的细胞大而高度液泡化的细胞，这类细胞分化能力较弱，一般不具备胚胎发生潜力，需经2代以上诱导后方能向胚性愈伤组织细胞转化或进入器官(不定芽、不定根)再生途径；另一类愈伤组织是由成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞组成，这类细胞具有成胚能力，因而，将这类愈伤组织又称为胚性愈伤组织。菠萝外植体脱分化所形成初始愈伤组织通常是非胚性愈伤组织。虽然其非胚性愈伤组织在特定条件下可通过定向诱导而成为胚性愈伤组织，再通过体细胞胚发生完成植株再生[1]，但在通常条件下。外植体脱分化形成愈伤组织后都是经器官发生途径来完成植株的再生。迄今为止，国内外对菠萝离体培养进行了较多研究[2-3]。但对其非胚性愈伤组织的类型和器官发生等研究还未见报道。我们对菠萝非胚性愈伤组织的类型及离体器官发生进行了组织细胞学观察，旨在探索非胚性愈伤组织在增殖和分化过程中组织细胞学变化规律，为进一步调控愈伤组织培养再生途径和提高体细胞胚诱导效率提供细胞学依据。
1 材料和方法
1 材料
供试菠萝品种为神湾(Ananas cv.Shen-wan)，采自华南农业大学园艺学院果园。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织诱导、增殖和分化培养按照何业华等[1]的方法，取菠萝吸芽在MS+2.0 mg/LBA+2.5md/L NAA上诱导愈伤组织，切下该愈伤组织转到增殖培养基MS+3.0meCLBA+2.0 mg/LNAA上增殖，每30d进行1次继代培养。
将不同类型非胚性愈伤组织切成约3 minx3 mmx3mm大小的小块分别接种于含NAA(0、0.1、0.5、1、2、3、5、7 mg/L)与BA(0、0.1、0.5、1、2、3、4、5、7 mg/L)不同质量浓度组合的培养基上，每瓶接种8块，设5个重复，30 d后统计观察拟原球茎、多芽体及不定芽的分化情况。
1.2.2 组织形态学观察将不同类型非胚性愈伤组织浸于FAA中固定24 h，按常规石蜡切片法制片，用苏木精整染[1]。切片在BH02 OLYMPUS双简显微镜观察拍照。
2 结果与分析
2.1 非胚性愈伤组织类型及外观特征
非胚性愈伤组织于增殖培养基上经过3次以上继代培养后，其形态上逐渐表现出一定差异。经过4 a共48代培养观察及结合细胞学的证据，按照非胚性愈伤组织的生长部位、结构特点、分化能力及胚性获得能力，可将其分为节瘤状组织(Globular andNodular Smcture，图版一a1、不规则薄壁组织团(Parenchyma Clumps，图版-b)、表面疏松愈伤组织fSurface Loose Calhs，图版-c)及致密深层愈伤组织(CompaetInteriorCallus，图版一d)等4种类型。节瘤状组织外表深褐色，组织结构紧密；不规则薄壁组织团表面白色，但表面还常有一些老化的褐色组织斑点；表面疏松愈伤组织外表浅绿色，表层密集疏松突出物：致密深层愈伤组织是以上3类愈伤组织靠近培养基的部分，色深而坚硬。
2.2 愈伤组织的器官发生类型及其细胞学特征
4种类型非胚性愈伤组织都可以通过不定芽(Adventitious shoots，图版-el、e2)、拟原球茎(又称类原球茎，pmtocorm-like bodies/PLBs，图版-fl、f2)、多芽体(Multiple Buds，图版-gl、g2)等器官发生途径-再生。
薄壁组织团(图版A)由较大的类似皮层细胞构成，含色素少或无，液泡大，输导组织丰富，在中高质量浓度(3-5 mg/L)BA培养基(含2～3 mg/L NAA)上诱导及增殖较快，分化能力较低，培养2-3代后开-始产生不定芽，再继代培养4代以上后会转为多芽体。节瘤状组织是由细胞壁次生增厚的类似木质部细胞组成(图版C、D)。含输导组织相对较少，比薄壁组织容易发生分化，它在中高浓度(3—5 mg/L)BA培养基(含2-3 mg/L NAA)上培养l代即有不定芽产生，3～4代后基本上都会成为多芽体，在含2，4～D的体细胞胚诱导培养基上较容易获得体细胞胚。表面疏松愈伤组织则在中高质量浓度(3～5 mg/L)BA培养基(含2～3 mdLNAA)中很容易分化出不定芽和发展成多芽体。致密深层愈伤组织通常需先增殖出新的愈伤组织后才再分化出不定芽，直至成为多芽体。
非胚性愈伤组织在增殖培养1～3代后也会部-分发生器官分化。根据3种器官发生途径之间的相互关系可将非胚性愈伤组织器官发生过程分为2种，一种是在其表面零星分化产生的一些不定芽(图版E、F)，再转移至分化培养基(MS+BA0，5 rag／L+NAA0.1 mg/L)上继续培养3-4代后常转为多芽体；另一种在其表面分化出拟原球茎，再通过拟原球茎形式进行植株再生，继续转移至再分化培养基培养3～4代后也会转为多芽体。
多芽体呈花椰菜状，发生后期是由莲座状的叶状体或不定芽基部愈合而形成，其基部为肉质白色薄壁细胞，由于薄壁细胞生长快速，内多含有较大空隙，顶部的芽原基非常不规则(图版B)。在减少或去除BA以后，芽原基进一步发育成不定芽。一般在培养20 d以后，多芽体开始形成茎部融合的叶状体，薄壁组织则易形成单个茎不明显的不定芽。
在增殖培养过程中4类非胚性愈伤组织都会产
生拟原球茎，其拟原球茎形成率(形成拟原球茎的愈伤组织块数占全部供试愈伤组织块数的百分比)在40％以上，而在MS+1.0 mg/L BA+3.0 mg/L NAA上则达98％。拟原球茎大小均一、卵圆形，增殖快，但器官发生能力最低：有些在发生后期具有单极的突出的芽，并能继而发育成植株。依生长素种类和浓度不同，拟原球茎呈黄绿至绿色(在含少量2，4-D培-养基上色泽偏黄)，形态和解剖学上类似于体细胞胚(图版G)，但是在基本培养基上继续培养往往缺少根的形成，不能萌发成完整植株，而在MS+1.0 mg/LBA+3.0 m/L NAA的非胚性愈伤组织增殖培养基上非常容易愈伤化而失去分化能力。已形成的拟原球茎以及愈伤组织表面部分是拟原球茎发生旺盛部位，拟原球茎的增殖能力不仅与培养基生长调节物质组成有关，且与培养时间、接种密度、与培养基的接触情况、周围组织的生长情况有关。通过在NAA(0、0.1、0.5、1、2、3、5、7 mg/L)与BA(0、0.1、0.5、1、2、3、4、5、7 mg/L)不同质量浓度组合的培养基上培养表明，拟原球茎的增殖系数可以从0到17.54,且较少依赖于培养基生长调节物质组成，如果拟原球茎增殖到一定密度，增殖将降低或停止。
在愈伤组织增殖继代过程中。一种类型的非胚性愈伤组织通常只会生长出同类型的非胚性愈伤组织。但通过改变培养基配方等方法一种类型的非胚性愈伤组织可产生出另一类型的愈伤组织。同时。继代过程中的器官发生现象非常普遍。通常是在薄壁愈伤组织表面细胞分化成具有分生能力的细胞，然后进行不定芽的分化。拟原球茎和多芽体更容易进行体细胞胚发生。
2.3 非胚性愈伤继代培养中生长调节物质质量浓度对愈伤组织增殖及分化的影响
非胚性愈伤组织增殖培养中，生长素及细胞分裂素对愈伤组织的形态结构、分化途径以及增殖能力有很大的影响。总的来说，当培养基中NAA质量浓度较高(≥3 mg/L)和BA质量浓度低f<0.5 mg/L)时，愈伤组织生长慢、褐化，不定芽大而散生，不定根发生频率增高；当NAA浓度稳定在2～3mg/L时，BA质量浓度升高(3～7 mg/L)则同时利于白色薄壁组织及多芽体形成(表1)，不定芽基部愈合，叶呈莲座状在薄壁组织顶端环绕；加入少量2，4-D(0.5～1m/L)可促进拟原球茎的发生，愈伤组织变黄而疏松，不定芽叶也变窄。
3 讨论
愈伤组织有胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，它们在生理生化和发育上都有明显差异，直接关系到其植株的再生，一定条件下相互之间还可以转变[4]。本研究中，菠萝非胚性愈伤组织的增殖非常容易，在一系列质量浓度的生长素fNAA、IAA、2.4-D1和细胞分裂素(BA)组合培养基中可得到良好的愈伤组织生长状况和增殖量。NAA浓度较高f≥3 mg/L)和BA质量浓度低(<0.5 mg/L)，不利于愈伤组织和多芽体的生长，利于不定根发生；BA浓度升高(≥3 m/L)则同时利于白色薄壁组织及多芽体形成。在菠萝愈伤组织增殖培养基继代过程中，不同类型的非胚性愈伤组织在分化的同时，通常只会增殖出同类型的非胚性愈伤组织，但分化出的拟原球茎和多芽体更容易进行体细胞胚发生[1]。
有研究者在菠萝离体培养中也发现，当细胞分裂素结合一定质量浓度的生长素(如NAA)，会生成“块状”组织以及拟原球茎，或者愈伤组织月，器官发生一般会经过节瘤状组织[6]。原球茎是兰科植物的一种再生方式，它最初是指兰花种子萌发过程中的形态学构造，在兰科植物离体培养中，拟原球茎多与体细胞胚发生密切相关。主要体现在体细胞胚发育后期通过拟原球茎形式进行植株再生[7-8]。拟原球茎的细胞学起源上还存在争议[9]。现在较为普遍接受的观点是，拟原球茎属于多细胞起源，而且只有单极性，因此在离体培养中与体细胞胚相区分。本实验所观察到的拟原球茎具有与兰科植物拟原球茎类似的形态学和组织学特征，而且在体细胞胚诱导过程中能高频地转化为胚性愈伤组织。多芽体是由类似皮层上的薄壁细胞以及形态学上端的不规则分生组织构成，这类有高度增殖能力的已分化组织也具有较高的胚性潜能㈣。
在通过愈伤组织进行体细胞胚发生的研究中，对初始愈伤组织形态、增殖分化情况、胚性诱导能力的描述及研究还很少见。前人的研究已揭示，外植体敏感性的不同可以解释它们对诱导培养基中的植物生长调节物质的响应差异[11]。植物种间、基因型间、甚至相同外植体的不同细胞间的敏感性都有差异，从而胚性获得能力也有所不同[12]。菠萝的非胚性愈伤组织虽然属于未分化细胞，但仍然显示出一定的细胞类型和形态学特征。通过增殖，能够保持原代细胞的各种性质，包括胚性诱导能力。在实际操作中，挑选利于诱导的组织(拟原球茎、多芽体)进行增殖有利于获得更多的胚性组织诱导效率。
4 结论
菠萝的非胚性愈伤组织可分为节瘤状组织、不规则薄壁组织团、表面疏松愈伤组织及致密深层愈伤组织等4个类型。它们都可以通过不定芽、拟原球茎、多芽体等器官发生途径完成植株再生：也可以经胚性诱导由体细胞胚发生途径再生成植株，其中拟原球茎和多芽体更容易进行体细胞胚发生。在增殖继代过程中。一种类型的非胚性愈伤组织通常只会生长出同类型的非胚性愈伤组织，但通过改变培养基配方等方法可使不同类型之间发生转换，同时，器官发生现象常见。生长素及细胞分裂素对非胚性愈伤组织的形态结构、分化途径以及增殖能力有很大的影响。4类非胚性愈伤组织在发生器官分化中，是先形成不定芽、拟原球茎，若继续将培养物在分化培养基上培养3～4代后则成为多芽体，并会大大加快不定芽增殖速度。(本文图版见封3)
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