[摘要] 目的 通过研究阿托伐他汀预处理对兔急性心肌梗死后1周心室肌细胞L－钙离子通道电流（ICa-L）的影响，探讨他汀类药物抗心律失常的细胞学离子机制。方法 60只新西兰大耳白兔随机分为3组：心梗组、阿托伐他汀治疗组和假手术对照组。采用结扎兔冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死动物模型，采用酶解的方法分离心室肌外膜单个心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术，记录跨膜ICa-L，同时检测各组血脂水平。结果 各组动物血脂水平无显著性差异。1周后对照组、心梗组和他汀组ICa-L电流密度峰值（0mV）分别为（-4.21±1.12）pA/pF（n=20），（-3.36±0.92）pA/pF（n=20）和（-4.05±0.56）pA/pF（n=20）。心梗组较对照组明显下降（P＜0.05），他汀组较心梗组明显升高（P＜0.05）。另外，心梗组ICa-L失活曲线较对照组左移，他汀组较心梗组右移。结论 急性心肌梗死可导致梗死区心肌细胞ICa-L明显下降，阿托伐他汀预处理可减轻ICa-L的异常变化，逆转电重构，而不依赖于降血脂效应，可能为他汀类药物降低心律失常发生率的细胞学离子机制。
[关键词] 阿托伐他汀；心肌梗死；膜片钳；钙离子通道
[中图分类号] R541.7；R542.2[文献标识码] A[文章编号] 2095-0616（2011）01-28-02
Effects of Atorvastatin on L-type Calcium Current in Ventricular Myocytes from Infarcted Heart ofNormocholesterolemic Rabbits
WANG Shujuan1DONG Jinjun2WANG Jianliang2
1.Division of Hospital Case Management, Nanlou Clinic Section, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2.Health Center, Cadre Sanatorium of Shijiazhuang Army Command College, Shijiazhuang 050084, China.
[Abstract] Objective To investigate the effects of atorvastatin on membrane L-type calcium current（ICa-L） in left ventricular myocytes of rabbit heart suffering from acute myocardial infarction（AMI），so as to explore the ionic mechanism of statin treatment for antiarrhythmia. Metheds Rabbits were infarcted by ligation of the left anterior descending coronary artery after administration of oral atorvastatin 5mg/（kg·d）（statin group） or placebo（AMI group） for 7 days. 1 week later，single ventricular myocytes were isolated enzymatically from the epicardial zone of the infracted region. Whole cell patch clamp technique was used to record ICa-L. Results There was not significantdifference in serum cholesterol concentration among three groups. The peak ICa-L current density（at 0 mV） was significantly decreased in AMI group（-3.36±0.92）pA/pF（n=20） compared with CON（-4.21±1.12）pA/pF（n=20），P＜0.05，while it was significantly increased in statin group（-4.05±0.56）pA/pF（n=20） compared with AMI group，P＜0.05. The steady-state inactivation curve was shifted significantly in the hyperpolarizing direction in AMI group comparedwith CON，while it was shifted in the right direction in statin group compared with AMI group. Conclusion It is indicated that AMI induces significant reduction in ICa-L. The ICa-L down-regulation may underlie the altered electrical activity of the surviving ventricular myocytes. Pretreatment with atorvastatin could attenuate this change without lowering the serum cholesterol level，suggesting that atorvastatin could reverse this electrical remodeling，thus contributing to the ionic mechanism of statin treatment for antiarrhythmia.
[Key words] Atorvastatin; Myocardial infarction; Patchclamp; L-type calcium ion channel
急性心肌梗死（AMI）后可发生各种心律失常，特别是室速、室颤，是导致心源性猝死的主要危险因素。AMI后梗死区及其边缘区缺血的心肌细胞可发生一系列电生理变化，形成电重构，为心律失常发生的细胞学机制。本文采用全细胞膜片钳技术，记录AMI后1周兔心室肌细胞跨膜ICa-L的变化，研究阿托伐他汀预处理对兔AMI动物模型心室肌细胞电重构的逆转效应，探讨他汀类药物抗心律失常的细胞学离子机制。
1材料与方法
1.1实验动物
健康新西兰大耳白兔45只，雌雄不拘，体重2.0～2.5kg，由大学实验动物中心提供。随机分为3组（每组15只）：急性心肌梗死模型组（心梗组），阿托伐他汀治疗组（他汀组）和假手术对照组。
1.2溶液与试剂
阿托伐他汀（立普妥，10mg）由辉瑞公司提供。试剂成分（mmol/L）如下：①台氏液：NaCl 136.9，NaHCO3 11.9，KCl 5.4，MgCl2 0.53， NaH2PO4 0.33，HEPES 5.0，Glucose10，用NaOH调节pH至7.3。②KB液：KOH 70，KCl 40，KH2PO4 20，L-glutamic acid 50，Tauringe 20，EGTA 0.5，HEPES 10，Glucose 10，用KOH调节pH至7.3。③ICa-L电极外液：氯化胆碱120，CsOH 4，CaCl2 1.8，MgCl2 2.0，HEPES 10，Glucose 10，用CsOH调节pH至7.3。加入4-AP（5mmol/L）、CsCl（20mmol/L）以阻断钾电流。④ICa-L电极内液:CsCl 80，MgCl2 2.0，ATPNa2 5.0，HEPES 10，EGTA 10，用CsOH调节pH至7.3。
1.3血脂测定
进行动物模型手术前，各组动物抽血进行总胆固醇测定（全自动生化分析仪）。
1.4AMI动物模型的建立
他汀组动物连续口服阿托伐他汀[5mg/（kg·d）]，心梗组和对照组同时口服安慰剂1周。动物采用2.5%硫喷妥钠1.0mL/kg耳缘静脉注射麻醉，利用针刺电极插入动物四肢皮下记录肢导心电图。沿左侧肋骨、胸骨交界处剪断肋骨，开胸后切开心包。分离并结扎冠状动脉左前降支，随之关闭缝合，即建立AMI动物模型。假手术对照组开胸后仅分离左冠状动脉前降支并穿线而不结扎，以排除开胸手术本身对心肌细胞电生理参数的影响。各组动物手术后单笼饲养1周备用。
1.5细胞分离
AMI动物模型建立1周后采用酶解的方法分离单个心室肌细胞。心梗组及他汀组细胞来源于心脏冠状动脉左前降支毗邻的左心室前壁外膜梗死区部位，特征为此梗死区外膜变为白色斑片状；对照组细胞则取自兔左心室前壁心室肌与梗死区相对应的部位。
1.6膜片钳全细胞记录
按Hamill法[2]进行，取上述制备好的心室肌细胞悬液数滴滴于灌流槽中，置于生物倒置显微镜（Olympus）下，静置5min待细胞沉底附壁后，用所测电流相应的灌流液灌流，灌流速度（2～3）mL/min，冲去死亡细胞碎片，选取表面光洁、横纹清晰的心肌细胞为研究对象。记录电极由硬质玻璃毛坯经水平拉制仪（Sutter P-97，USA）四步拉制而成，内充电极内液后阻抗为2～3MΩ。采用三维液压微操纵器将电极靠近细胞进行封接，负压吸引致封接阻抗达1GΩ以上，吸破细胞膜，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录模式。脉冲信号由Pulse+Pulsefit软件（HEKA，version 8.53），控制，通道信号经EPC-9膜片钳放大器（HEKA，德国）放大，通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9转换，为Pulse+Pulsefit软件收集、分析。各电流幅值除以细胞膜电容所得即为电流密度，以不同钳制电压下的电流密度绘成电流-电压关系（I-V）曲线。所有实验在室温（25℃）下进行。
1.7统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件，计量资料以（χ±s）表示，组间比较采用方差分析q检验。以P＜0.05作为显著性差异的指标。
2结果
2.1血脂的变化
对照组、心梗组、他汀组动物血清总胆固醇水平无显著性差异（2.75±0.85） vs （2.98±0.38） vs （2.89±0.29）mmol/L，n=20，（P＜0.05）。
2.2阿托伐他汀对心室肌细胞ICa-L I-V曲线的影响
从HP -50mV始，阶跃+10mV，逐步去极化到+40mV，时程250ms，引出ICa-L。以不同钳制电压下的ICa-L电流强度绘成I-V曲线。记录ICa-L时，HP在-50mV，钳制电压也保持不低于-50mV，可抑制钠通道的活性，同时使T型钙通道失活。灌流液中加入4-AP、CsCl以去除钾电流，给予无K+、Na+灌流液以进一步去除钠钾电流的干扰。电极内液中加入EGTA以螯合钙离子，减慢电流失活。电流均在细胞破膜后10～20min记录，避免ICa-L的衰减现象造成误差。3组心室肌细胞ICa-L的I-V曲线，均在-40mV激活，0mV达峰值，+50mV时反转。心梗组与对照组相比，I-V曲线上移。他汀组与心梗组相比，I-V曲线下移，接近对照组。但ICa-L电压依赖性不变，对激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无影响。
ICa-L电流密度峰值（0mV）的比较显示：对照组为（-4.21±1.12）pA/pF（n=20），心梗组为（-3.36±0.92）pA/pF（n=20），较对照组显著下降（P＜0.05）；他汀组为（-4.05±0.56）pA/pF（n=20），与心梗组相比，明显升高（P＜0.05）。他汀组与对照组相比，无明显差异。AMI可导致ICa-L明显抑制，辛伐他汀治疗可逆转这种变化。
2.3阿托伐他汀对心室肌细胞ICa-L失活曲线的影响
采用双脉冲刺激法，HP=-50mV，条件脉冲为-80mV～+40mV，钳制时间500ms，阶跃+10mV，每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到+10mV的测试脉冲，持续时间250ms，将记录的ICa-L与最大激活时的ICa-L之比，与相应的条件脉冲膜电位作图得钙通道失活曲线。并通过Pulse+Pulsefit软件用Boltzmann方程计算出ICa-L半数最大失活电压（V0.5）。心梗组与对照组相比，ICa-L失活曲线明显左移（即向超级化方向移动），他汀组较心梗组明显右移，接近对照组。对照组V0.5为（-18.2±4.4）mV（n=20），心梗组为（-24.2±6.3）mV（n=20），与对照组比较相差显著（P＜0.05）。他汀组为（-20.3±5.7）mV（n=20），与心梗组比较差异显著（P＜0.05）。
3讨论
他汀类药物3－羟基－3甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）抑制剂可通过调脂作用明显降低心血管事件发生率。近年来随着4S、CARE、LIPID、WOSCOPS等一系列大规模随机临床试验的揭晓，显示他汀类药物不仅能降低血脂水平，而且有独立于降脂作用之外的其他有益作用，称之为他汀的多效性，其中抗心律失常作用更是热点之一。动物实验研究及临床研究显示他汀类药物预处理可明显降低心律失常的发生率。所以，他汀类药物的心脏保护效应部分得益于其抗心律失常效应，但其抗心律失常效应机制目前仍不明确。
本文成功建立AMI动物模型，采用膜片钳全细胞技术，研究结果表明，AMI后梗死区心室肌细胞ICa-L受到抑制，其峰值电流明显降低，可引起梗死区心室肌细胞动作电位2相时程相对缩短，该部位心肌复极相对加速，从而导致各部位心室肌复极不一致，容易形成室内折返，发生室性心律失常。并且AMI后不同部位心室肌细胞ICa-L及动作电位变化的异质性，更增加了心律失常发生的几率。另外， ICa-L的下降减弱了钙离子对肌浆网的调节作用，导致细胞内钙离子的积聚，产生振荡性后电位，通过触发活动导致室性心律失常。辛伐他汀预处理可减轻AMI后离子通道的异常变化，使下降的ICa-L上调，恢复跨膜离子通道活性，逆转电重构，从而产生抗心律失常作用。
阿托伐他汀逆转AMI后细胞电重构的机制尚不明确，推测其机制可能与他汀类药物的多效性有关，包括他汀的稳定斑块、改善内皮细胞功能、抑制血小板活性、抗炎抗氧化、改善左室功能、减少心肌梗死面积和无复流[2]等效应。这些作用可通过降低上游损伤，从而改变跨膜信号转导通路及离子通道的特性，影响通道蛋白的表达和合成[3]，改善心肌细胞电生理稳定性，所以我们认为，他汀的抗心律失常效应是通过心脏的整体多效性机制实现的。
阿托伐他汀预处理可以逆转电重构，而不依赖于其降血脂效应，可能为他汀类药物降低心律失常发生率的细胞学离子机制。他汀类药物没有传统抗心律失常药物可能出现的促心律失常的副作用，应当成为临床治疗心律失常的一个新的重要靶点。
[参考文献]
[1] Hamill OP，Marty A，Neher E，et al. Improved patch-clamp teachniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches[J]. Pflugers Arch，1981，391:85-100.
[2] 丁超，傅向华，陈会校，等. 辛伐他汀对兔缺血再灌注后梗死面积的影响[J]. 岭南心血管病杂志，2008，14（6）:437-439.
[3] Shiroshita-Takeshita A，Schram G，Lavoie J，et al.Effect of simvastatin and antioxidant vitamins on atrial fibrillation promotion by atrial-tachycardia remodeling in dogs[J]. Circulation，2004，110:2313-2319.
（收稿日期：2010-10-28）
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