产生物表面活性剂石油降解菌Bacillus,BS—8的生物学特性

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株BS-8（Bacillus sp.），从长期受石油污染的土壤中筛选到[4]。

1.1.2 培养基 LB培养基（g/L）： 胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂20；pH 7.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20.0，（NH4）2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 2.0，Na2HPO4 2.0，CaCl2·H2O 0.005；pH 7.0～7.2

1.2 方法

1.2.1 测定方法 排油圈的测定参考王大威等[5]的方法，表面张力的测定参考曹娟等[6]的方法。

1.2.2 菌株BS-8的生长与产表面活性剂的动态关系试验 将菌株BS-8以10%的接种量接种到发酵培养基中，30 ℃、160 r/min振荡培养，每隔6 h取样，用紫外分光光度计测定发酵液的OD600 nm，并测定离心后的发酵上清液的表面张力及排油圈直径。

1.2.3 影响菌株BS-8产表面活性剂的因素试验 微生物的生长需要充足的碳源、氮源等营养物质，还需要合适的培养条件如温度、pH、渗透压等。为确定菌株BS-8的最佳生长及产表面活性剂的条件，研究了碳源、氮源、温度、pH和NaCl浓度对菌株产表面活性剂的影响。按照5%的接种量，将菌株BS-8于30 ℃、160 r/min摇床培养48 h，并测定离心后的发酵上清液的排油圈直径。具体设计见表 1。

2 结果与分析

2.1 菌株BS-8产表面活性剂与菌体生长的动态关系

菌株BS-8在发酵培养基中振荡培养，定时取样，测定发酵液的OD600 nm及离心上清的表面张力和排油圈直径，结果如图1所示。有研究表明，生物表面活性剂是细菌细胞生长过程中产生的代谢产物，其产生与菌体生长有相关型和非相关型两类[7]。一定浓度范围内，发酵液中表面活性剂的含量与表面张力呈反比[8]。发酵液的表面张力反映了菌株产表面活性剂的能力。图1表明，在发酵培养基中菌株在6 h时已开始产表面活性剂，6～30 h内菌体数量迅速增加，发酵液的表面张力随菌体数量的增加而降低，表面张力快速下降（从63.2 mN/m下降为39.4 mN/m）。随着菌体数量缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。30～54 h间细菌数量达到最高值，发酵液的表面张力也降至最低值34.1 mN/m。54～72 h间，菌体数量有所下降，表面张力有所增加。

排油圈直径与发酵液中表面活性剂含量呈正相关，与表面张力呈负相关，即表面张力越大，排油圈直径越小。由图1可知，6～30 h上清液的表面张力快速下降，而排油圈直径从11 mm增大到62 mm，随着培养时间的增加，上清液表面张力持续下降但降速减慢，排油圈直径维持在62 mm左右。据以上分析，推测菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型。

2.2 不同因素对菌株BS-8产生表面活性剂的影响

2.2.1 菌株BS-8产表面活性剂的最适碳源 碳源是菌体生长和产生代谢产物必不可少的营养基质，充足的碳源决定了菌株产表面活性剂的产量。分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉作为发酵培养基中的碳源，经过48 h的培养，测定各发酵液的排油圈大小。从图2可知，以葡萄糖为碳源时，排油圈直径最大达到62 mm，其他几种碳源产生的排油圈均小于以葡萄糖为碳源产生的排油圈。即葡萄糖为碳源的发酵培养液中生物表面活性剂的含量最高，所以培养液的碳源选择葡萄糖。

2.2.2 菌株BS-8产表面活性剂的最适氮源 分别以硫酸铵、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸铵作为发酵培养基中的氮源，经48 h的培养，测定发酵液的排油圈大小。图3数据表明，不同的氮源对菌株BS-8产表面活性剂的量有较大的影响。以酵母膏为氮源时，排油圈直径最大达到66 mm，均大于其他几种氮源产生的排油圈，几种氮源的效果大小顺序为酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、尿素。

2.2.3 菌株BS-8产表面活性剂的最适温度 菌株BS-8在不同温度下培养，发酵上清液产生的排油圈大小也不同，说明温度对菌株产表面活性剂的能力有一定的影响。由表2可知，在20～40 ℃的范围内菌株BS-8的排油圈直径较大，60 ℃时仍具有产表面活性剂的能力，说明该菌株具有较广的生长温度范围。当培养温度为30 ℃时，排油圈直径达到67 mm。

2.2.4 菌株BS-8产表面活性剂的最适pH 菌株BS-8接种在不同pH的培养液中，经振荡培养，其产表面活性剂的能力如表3所示。不同pH下，发酵上清液产生的排油圈大小不同，说明pH影响菌株产表面活性剂的能力。由表3可知，菌株BS-8在pH 6.0～9.0范围内排油圈直径较大。当pH为7.0时，排油圈直径最大达到65 mm，发酵液中表面活性剂的含量最高。

2.2.5 菌株BS-8产表面活性剂的最适NaCl浓度 菌株BS-8在不同NaCl浓度的发酵液中培养，其产表面活性剂的能力如表4所示。由表4可知，发酵培养基中不同浓度的NaCl对菌株产表面活性剂的产量有较大影响，菌株BS-8在NaCl浓度为10～30 g/kg 的范围内均生长良好，能耐受浓度50 g/kg的NaCl， 当NaCl浓度为20 g/kg时，排油圈直径最大。

3 结论与讨论

对生物表面活性剂的特性研究表明，其适用于石油工业和环境工程，因此生物表面活性剂的研究与开发逐渐成为国内外的研究热点[9]，生物表面活性剂的生产方法主要有微生物发酵法和酶催化法两种。根据微生物的种类和目标产物的不同将发酵法分为四种：生长细胞法、代谢控制的细胞生长法、休止细胞法和加入前体法[10，11]。目前只有少数产品走向市场，主要原因是生物表面活性剂的生产成本较高。通过选育高产菌株、改进发酵工艺及提高生物表面活性剂的产率可以降低其成本，使其走向大规模工业化生产。菌株BS-8（Bacillus sp.）是从长期受石油污染的土壤中筛选到的高产生物表面活性剂的菌株，对其生长与产表面活性剂的关系进行了研究，并对影响其产表面活性剂的因素进行了探讨。菌株BS-8产表面活性剂与菌体生长的动态关系表明，菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型，排油圈直径与发酵液中生物表面活性剂含量正相关，与表面张力负相关。以排油圈直径表征发酵液中生物表面活性剂的含量，不同因素影响了菌株产表面活性剂的能力，菌株BS-8高产表面活性剂碳源、氮源分别为葡萄糖、酵母膏，最适培养温度30 ℃，最适pH 7.0，最适NaCl浓度为20 g/kg。

参考文献：

[1] CAMEOTRA S S， MAKKAR R S. Recent applications of biosurfactant as biological and immunological molecules[J]. Current Opinion in Microbiology， 2004， 7（3）：262-266.

[2] 钱欣平，阳永荣，孟 琴.生物表面活性剂对微生物生长和代谢的影响[J].微生物学通报，2002，29（3）：75-78.

[3] KIM H S，JEON J W， KIM B H， et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant， mannosylerythritol lipid， by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006， 70（4）：391-396.

[4] 夏铁骑，常慧萍，张建清.产生物表面活性剂石油降解菌的筛选及高效降解菌群的构建[J].农业灾害研究，2013，3（6）：49-51.

[5] 王大威，刘永建，林忠平，等.一株产生脂肽的枯草芽孢杆菌的分离鉴定及脂肽对原油的作用[J].微生物学报，2008，48（3）： 304-311.

[6] 曹 娟，徐志辉，李凌之，等.产生物表面活性剂的石油降解菌Acinetobacter BHSN的研究[J].生态与农村环境学报，2009，25（1）：73-78.

[7] ABOUSEOUD M， MAACHI R， AMRANE A， et a1. Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of biosurfactant by Pseudomonas fluorescens[J]. Desalination，2008， 223： 143-151.

[8] 马 强，林爱军，马 薇，等.土壤中总石油烃污染（TPH）的微生物降解与修复研究进展[J].生态毒理学报，2008，3（l）：l-7.

[9] PORNSUNTHORNTAWEE O， MAKSUNG S， HUAYYAI O， et a1. Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa SP4 using sequencing batch reactors： Effects of oil loading rate and cycle time[J]. Bioresource Technology， 2009， 100：812-818.

[10] 李祖义，杨勤萍.生物表面活性剂的合成（一）[J].精细与专用化学品，2002（15）：6-8.

[11] 郑新伟.一株生物表面活性剂产生菌的分离及其产物性质的研究[D].西安：西北大学，2011.

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