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= M= }COGSOG_iE3Diըky"http://www.gzzcxlzx.com/t/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料及处理 试验材料热引1号胡椒来自胡椒标准化种植示范园，为中国主栽品种，中感胡椒瘟病；黄花胡椒（Piper flaviflorum）来自农业部胡椒种质资源圃，为栽培种的野生近缘种，中国特有物种，主要分布在云南东南和西南部，高抗胡椒瘟病。切取健壮无病虫害的当年生主蔓，修剪成长度约40～60 cm、具4～7节和6～12片叶的扦插苗，采用沙培法植于温室中，待生根后进行针刺接种。将辣椒疫霉菌孢子用无菌水稀释至每毫升约5×106个，用于针刺接种。抗/感种质材料种苗均分为2组，按照如下方式进行：一组材料作为接种组，每个苗针刺3次；另一组作为对照组，用无菌水替代病原孢子液，同方法针刺接种。针刺处理在30 min内完成。根据Panstruga等[11]研究，接种后48 h 内是病菌孢子萌发、侵染以及植物体内受体识别侵染信号并做出反应的关键时期，因此接种组取样时间为未处理即0 h，以及处理后的8，12和24 h，分别取接近主蔓的根部组织用于后续试验。取样后立即投入液氮中，并迅速转移至实验室-80 ℃保存备用。
1.1.2 试剂及核酸测序 RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自Axygen公司，逆转录酶、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α菌株购自TaKaRa公司，SYBR Green qRT-PCR试剂盒购自伯乐有限公司，核酸测序和引物合成委托上海英骏生物公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 参照试剂盒方法提取总RNA。取2 μg RNA样品根据反转录试剂盒说明书合成cDNA。
1.2.2 胡椒NPR1基因的克隆 搜索胡椒EST数据库（SRS856941），根据CL4128.Contig2_F0463-PN序列设计引物CL4128-F-S和CL4128-F-A（表1），以胡椒根部组织cDNA为模板进行PCR扩增，程序为：94 ℃预变性4 min，30个循环（94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）72 ℃延伸7 min。PCR 产物（基因片段A）回收后连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序。
1.2.3 胡椒PnNPR1序列的生物信息学分析 利用NCBI网站中的BlastX对序列进行比对，系统进化分析选取同源性>30%的序列进行。蛋白理化性质分析利用Protparam在线分析软件（http：//web.expasy.org/protparam/）进行，用Prosite数据库分析氨基酸序列的功能域，预测蛋白是否存在信号肽和亚细胞定位使用PredictProtein工具（https：//www.predictprotein.org/），用SPORT软件（http：//psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）进行亚细胞定位分析，用PHD工具分析蛋白二级结构，利用DNAman软件构建同源性和系统进化树。
1.2.4 PnNPR1定量PCR分析 以PnHistone3基因为内参对照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ进行定量PCR分析，引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环。每个样品进行3次重复，所有的样品数据分析，相关基因的表达使用2-△△CT方法定量，结果为平均值±SD。统计学分析采用SPSS20.0统计分析软件进行数据处理，定量比较采用t检验方法，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 PnNPR1基因cDNA序列的克隆
基于已获得的胡椒EST序列片段，在目的基因的5′端和3′端设计引物扩增出目的基因，获取2 kb左右片段。去除载体序列，该基因全长1 712 bp，包含一个1 362 bp的完整开放阅读框，编码454个氨基酸残基的蛋白质，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，5′端非编码区326 bp，3′端非编码区32 bp，推测的氨基酸与核酸序列见图1。
2.2 生物信息学分析
PnNPR1蛋白的分子式为C5 212H8 714N1 712O2 198S344，编码454个氨基酸残基，相对分子质量为141.56 ku，等电点为4.98，理论推导半衰期大于10 h，属于不稳定蛋白。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸是Thr（485个，28.3%）、Ala（474个，27.7%）、Gly（409个，23.9%）、Cys（344个，20.1%），Pyl和Sec的含量为0。总的带负电荷的残基（Asp+Glu）和正电荷的残基（Arg+Lys）均为0，亲水性平均数为0.707，预测该蛋白为水不溶性蛋白。根据SPORT软件分析结果，预测该基因主要分布在细胞核（47.8%）和细胞质（34.8%）中，无信号肽。NCBI对其保守结构域进行分析表明，该基因含有ANK锚蛋白重复序列、BTB/POT结构域、DUF和NPR1-like C等4个结构域（图2）。
蛋白质多肽链通常折叠和盘曲成比较稳定的空间结构，蛋白质的空间结构与其特定生物学功能密切相关。常见的二级结构有α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-pleated sheet）、β-转角（β-turn）、无规则卷曲（Random coil）、延伸链（extend strand）等。PHD软件分析表明，PnNPR1主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成，3种结构所占比例分别是60.49%，25.17%和7.73%（图3），可见α-螺旋是PnNPR1最主要的二级结构。
从NCBI网站上获取其他作物的NPR1氨基酸序列，将PnNPR1氨基酸序列与其它植物的NPR1比较，发现PnNPR1与苜蓿（Medicago truncatula）、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）等作物的NPR1家族成员的同源性分别达到63.4%，46.4%，46.2%和46%（图4）。构建的进化树表明，PnNPR1最先与苜蓿NPR1聚合；与番茄、葡萄、杨树、大豆序列进化距离均较远，推测这种现象可能与物种起源地有关，同时胡椒是基部被子植物中最大的属之一，属于传统的木兰亚纲（图5）。
2.3 PnNPR1的表达模式分析
以histone3为内参，用real-time PCR方法分析PnNPR1表达模式。结果显示，PnNPR1在热引1号胡椒不同组织中均有表达，表达水平从高到低依次为叶、茎、根、花（图6）。
以病原菌侵染后不同时间点的根部cDNA为模板进行qPCR分析来研究PnNPR1基因的表达特征，结果表明：在处理前，黄花胡椒与热引1号胡椒的PnNPR1表达量均较低，辣椒疫霉菌诱导后，PnNPR1基因的表达量在2种种质中都明显增加，随着处理时间的延长，该基因呈现出先增加后降低的变化趋势；处理后12 h表达量达到最大，随后开始下降，并且，所有处理时间下，黄花胡椒的表达量均大于热引1号胡椒（图7）。
3 讨论与结论
项目组前期研究中获得了一个与NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特异序列[12]，根据此序列从胡椒中克隆得到一个NPR1基因，将其命名为PnNPR1。对该基因进行生物学信息分析，预测该蛋白为水不溶性蛋白，主要分布在细胞核和细胞质中，研究表明NPR1功能发挥非常必要的条件就是核定位特性[13]，NPR1蛋白在非诱导状态下通常以多聚体形式存在于细胞质内，一旦发生SAR诱导，NPR1蛋白氧化为单体并转移到核内，与多种TGA转录因子相互作用并激活PR基因表达，最后导致植物产生免疫反应[14]。PnNPR1基因同时具有植物NPR1所共有的保守结构域，其中BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列这2个结构域对NPR1基因发挥其功能极为重要，同时涉及蛋白质与蛋白质之间的相互作用，前期对这些区域高保守的氨基酸进行点突变的结果验证了这一说法[15-17]。另有研究表明NPR1基因与TGA转录因子结合的必要元件是ANK结构域，正向调控PR基因表达，使植物产生SAR[18]，推测NPR1可能通过与其它蛋白的相互作用参与调节植物防卫反应。
本研究中，接种辣椒疫霉菌后不同时间下，PnNPR1基因在根、茎、叶和花中均有表达，且表达存在明显差异，其中叶片中的表达量最高，花的表达丰度最低。这与荆州黑麦ScNPR1基因的表达相似，均在叶中表达量较高，而拟南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均无组织特异性表达，推测NPR1组织特异性表达可能与不同物种有关。
NPR1是SAR的一个中心元件，表达在PR基因之前，但在SA积累之后阻止SAR信号的发生[19]。NPR1基因在正常植株中有少量表达，当用SA或INA处理[20]或病原菌侵染时[21]，其表达量可提高大约2～4倍，本研究发现胡椒PnNPR1基因在辣椒疫霉菌侵染下表达量都升高，且不同时间段其表达差异显著，在12 h下到达最高值，产生这一现象可能是因为PnNPR1的转录受到病原菌的反馈机制调节，使蛋白维持在一定的水平，进一步说明了PnNPR1基因调控胡椒瘟病及信号传导中的重要作用。研究同时显示，将从水稻中克隆的OSNPR1基因在水稻中高表达，能够提高该作物对白叶枯病和稻瘟病的抗性[22]；从抗黄枯萎病海岛棉克隆获得GbNPR1基因，将其转入到烟草中，可显著提高转基因烟草对赤星病菌的抗性，且其转录水平受棉花黄萎病原菌诱导[23]。另外，本研究发现，胡椒抗病种质（黄花胡椒）与感病种质（热引1号胡椒）受辣椒疫霉菌侵染后表达存在差异，不同时间段抗病种质的表达量都略高于感病种质，这说明不同抗性水平的胡椒种质PnNPR1基因的表达模式也存在一定的差异，这与橡胶树HbNPR1基因的表达结果相近[24]。抗病种质PnNPR1基因表达增强，有助于激活下游防卫基因的表达，从而产生系统获得抗性。本研究中胡椒PnNPR1基因的获得及其表达模式为开展PnNPR1功能与分子机制的研究及培育胡椒新品种奠定基础。
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