摘 要 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验是高校生物化学实验必开实验项目之一，但实验影响因素较多。针对影响实验的各种可能因素进行分析并提出相应改进对策，以期为提高本实验的成功率提供一些可供借鉴的经验。
关键词 血清蛋白；醋酸纤维薄膜；实验仪器
中图分类号：Q5-33 G642.423 文献标识码：B 文章编号：1671-489X（2013）12-0132-03
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等各种蛋白质的氨基酸组分、立体构象、相对分子质量和等电点不同，在电场中的移动速率不同，通过电泳分离的一种方法[1]。因为其具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点，成为生物化学实验课必开的实验项目之一。但在实际的操作中，影响实验的因素较多，除了电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象等因素外，实验课课前准备工作是否到位以及实验过程中学生的实验操作水平也直接影响实验结果的准确性和完整性。笔者结合多年实验教学经验和他人研究工作，对整个实验操作过程中需要注意和改进的地方进行阐明，期望为提高实验的成功率提供一些可供借鉴的经验。
1 实验课课前准备
1.1 实验材料
1）血清。本实验室一直以小牛血清代替人血清用于实验课程的教学，取得较好的实验效果。且有研究证实[2]，牛血清代替人血清进行醋酸纤维素薄膜电泳，其结果与人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果相近，实验稳定，重复性好。小牛血清相较于宝贵的人血清，较易获得且储存稳定，组分纯净，没有其他杂质干扰，为实验结果的准确性提供了很好的保证，用于实验课教学完全可以达到预期的实验目的和要求。
实验用血清标样的质量问题是直接影响电泳结果的关键要素[3]。用不新鲜或溶血血清标样进行电泳，容易造成电泳图谱区带不清晰，更有甚者会出现拖尾现象。因此，血清应采用清澈透亮且无溶血现象的标样，且解冻后的血清必须置于冰箱4 ℃冷藏储存，每次实验前需仔细观察，如出现浑浊或溶血现象要及时更换，保证血清的新鲜。
2）醋酸纤维素薄膜。醋酸纤维素薄膜的质量对电泳的结果有很大的影响。薄膜厚薄质地均匀，无光泽面（糙面）微孔均匀，在电泳时跑出的区带均匀；相反，质地不均匀，无光泽面（糙面）微孔不均匀，在电泳时会造成区带不清晰，蛋白质在白色斑点处不泳动的现象，影响电泳图谱的完整性。因此，电泳时要选择厚薄质地比较均匀的薄膜进行电泳，其辨别方法是：用镊子取干薄膜轻放在电极缓冲液的表面，如薄膜迅速湿润，且整条色泽深浅一致，则表明此薄膜质地均匀；如薄膜表面出现深浅不一的条纹或斑点等，则表明此薄膜质地不均，应舍弃不用[4]。
1.2 实验仪器
1）电泳仪电源。应选择电压、电流等各项性能指标均稳定的电泳仪电源。笔者曾用即将淘汰的不稳定电泳仪电源进行电泳实验，所得到的电泳图谱区带分离不清，容易出现拖尾及跑偏等现象，严重影响实验结果的准确性。
2）电泳槽。电泳槽准备时，要首先检查槽中铂金丝连线是否正常连接正负极插口。若掉线，电泳时会造成蛋白质不泳动，无法跑出相应的区带。制作电泳槽上的滤纸桥要根据膜支架的长度和高度裁剪大小合适的滤纸，一般要采用双层滤纸桥。另外，将滤纸桥用缓冲液湿润后，要用玻璃棒轻轻朝一个方向挤压，赶掉里面的气泡，使滤纸紧贴在膜支架上。整个实验期间，盛有电极缓冲液的电泳槽应处于封闭状态，以防缓冲液的蒸发改变其pH值及离子强度，对实验结果造成影响。
3）点样器。实验教材[1]选用载玻片作为点样器，由于其长端截面较厚，且玻片宽度稍比薄膜宽，点样时容易使血清过多，横跨薄膜，最终导致电泳后电泳图谱蛋白质分离不均，有明显的边缘效应，且易产生拖尾现象。因此，实验室选用小巧的盖玻片作为点样工具，其端面佷薄，容易切割，点样时较易形成细条带，增加电泳的成功率。
1.3 实验试剂
1）电极缓冲液。应根据所测样品理化性质，从缩减电泳时间和提高图谱分辨率出发选择缓冲液的种类、离子强度和pH。血清蛋白纤维素薄膜电泳可选用pH8.6，离子强度在0.06～0.09之间的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液，这两种缓冲液共有的优点是具有强挥发性，对显色和紫外光等观察区带无影响。另外，用硼酸缓冲液作为电极缓冲液进行电泳，具有使电泳图谱更清晰完整、无毒副作用、费用低、使用时效长等优点[5-6]，其取代传统的巴比妥缓冲液必将成为一种趋势。
缓冲液配制时，为保证其离子强度和pH，应用电子分析天平精确（0.001 g）称量，定容后再用pH计校正。
2） 染色液。染色液选择的一般原则是染料对被分离样品有较强的着色力，水溶性好、稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定，且易洗脱比色[7]。实验通常选择较易脱色的氨基黑10B作为染料，也可选择丽春红等。
3） 漂洗液。漂洗液由于用的是易挥发的乙醇和乙酸作为主要原料，所以一般临用时配制或配好后密闭，防止其挥发，影响漂洗效果。
2 实验实施过程
2.1 薄膜的准备
用镊子夹取薄膜，分辨其无光泽面（糙面），无光泽面（糙面）向下一条一条放入盛有电极缓冲液的培养皿或大烧杯中，用镊子轻轻地压薄膜的表面，使其完全浸泡在电极缓冲液中，浸泡时间不少于30 min。如时间过短，则不能保证膜片上有一定量的缓冲液，难以使其恢复原来多孔的网状结构[2]。禁止一次夹取多条薄膜一起放入电极缓冲液中，这样容易造成浸泡不均匀状况，影响电泳的效果。
将浸泡好的薄膜用镊子取出，放在滤纸上，轻轻吸取多余的水分，这个过程以薄膜“不干不湿”为标准。若吸得过干，电泳时电流无法通过，蛋白质不泳动，无法得到正确的图谱；若吸后薄膜较湿，点样时血清易扩散，点样线过宽，得到的电泳图谱蛋白分离不开，且容易连成一片，影响结果观察。
另外，实验操作中严禁用手去触碰薄膜，以免沾污薄膜，影响实验的准确性。
2.2 点样
将吸去缓冲液的薄膜在日光灯下分辨其无光泽面（糙面）后，无光泽面（糙面）向上，放在载玻片上，保证薄膜的平稳性，以备点样。点样是整个实验的关键所在，它直接影响到电泳后图谱的完整性和准确性。因此，点样前应让学生用盖玻片沾取血清在滤纸上反复练习几次，直到掌握了点样技术，有把握后，再正式在薄膜上点样。
正式点样，用玻璃棒沾取血清，均匀地涂在盖玻片的端面上，以“印章法”垂直地点在薄膜无光泽面（糙面）一端1.5～2 cm处，使样品成一条状涂于薄膜上。点样时，应做到轻、稳、准。点样的量最好能控制在1 ul/cm，相当于60～80 μg[8]。点样过少，电泳后显色不清晰；过多，则不易分离且容易拖尾。
2.3 上样
用镊子夹取点好样的薄膜搭于电泳槽内双层滤纸桥上，称为上样。上样时应注意：1）点样端要位于电泳槽的负（阴）极；2）无光泽面（糙面）向下；3）点样线要悬空，离双层滤纸桥有一定的距离，不能贴于滤纸桥上；4）薄膜要拉直，中间不能有弯曲；5）薄膜要紧贴于滤纸桥上，中间不能有气泡；6）相邻薄膜间不能靠得太近，要留有2～5 mm左右的空隙；7）上样后，要盖上电泳槽的盖子平衡5～10 min，使薄膜完全湿润后，再进行电泳。
2.4 电泳
将电泳仪电源与电泳槽的正负极正确连接后，打开电泳仪电源进行通电电泳。因为使用的电泳仪和电泳槽不同，以及每次实验所上样的薄膜数量也不一样，所以不能直接照搬实验教材[1]所给的电压110 V，电流0.4～0.6 mA/cm膜宽（薄膜数量的总宽度），通电时间45～60 min进行电泳。实践也证明，这样电泳所得到的图谱蛋白分离不好，效果较差。因此，应从实际出发，根据滤纸桥正负极之间的宽度和所放薄膜数量的多少来计算所用的电压和电流。经过反复试验，电压一般稳定在130 V，电流控制0.6～0.8 mA/cm膜宽。由于本实验一直安排在秋季末进行，天气比较凉，所以电泳时间应当适当延长，控制在70～90 min，所得到的电泳图谱分离效果比较好。
电泳过程中，电极缓冲液的离子强度和pH的改变会影响到血清蛋白的分离效果。缓冲溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢，反之则越快；pH距等电点越远，质点所带电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢[9]。有研究[10]证实：通过混合正负极电极缓冲液的方法，能显著延长缓冲液的使用时效。因此，每次电泳后，应及时检测缓冲液pH，特别是阳极（正极）pH的变化，电泳2～3次后，将正负极缓冲液混合后使用，并观察实验后图谱的分离效果，如分离不好，应全部倒掉，重新配制新的电极缓冲液，保证实验结果的准确性。另外，电泳开始后，严禁再取放薄膜，以防触电，发生事故。
2.5 染色
染色时应将薄膜完全浸在染色液里，并时不时晃动装有染色液的培养皿，使其充分染色。如染色多条，要避免薄膜之间相互重叠，否则会造成染色不均，脱色后背景色浅的情况。染色时间一般应掌握在10 min左右。用过的染色液可以回收重复利用，节约资源。但有研究[11]发现，染色液重复使用次数过多，会使蛋白区带染色不均，出现空泡样现象。因此，一旦出现此种情况，应立即重新配制染色液。
2.6 漂洗
漂洗时应采用“少量多漂”或“连续漂洗”[4]的方法。“少量多漂”针对个组学生，每次用少量能没过薄膜的漂洗液漂洗，一般3～4次就能漂洗干净。“连续漂洗”针对多组学生，放置几个盛有漂洗液的培养皿，依次排开，学生连续漂洗。这两种方法的运用，都能达到漂洗的效果，且节约资源，保护环境。
3 结束语
综上所述，诸多因素影响着血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳，实验中任何一个环节的处理不当，都会影响实验结果的准确性和完整性。为了获得好的实验结果，满足实验教学目的，达到实验教学效果，除了教辅人员认真进行课前准备，做好预实验外，还需要课前让学生提前预习实验内容，了解实验操作要点；课上认真规范学生操作，把握每个操作环节；课后及时总结实验经验和教训。相信注意了以上细节，血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的成功率将大大提高。
参考文献
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