摘要：以2，3-环氧丙基三甲基氯化铵（EPTAC）作为改性剂成功合成了具有良好水溶性的壳聚糖季铵盐（HTCC）；通过傅立叶红外图谱（FT-IR）、氢核磁共振（1H NMR）对其进行了结构表征；研究HTCC在不同浓度、pH、金属离子条件下对花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盘孢（Colletotrichum coccodes）4种植物病原真菌的抗菌活性；对其抗真菌机理进行了初探。结果表明，2.0 mg/mL的 HTCC对花生尾孢菌、苹果轮纹病菌的抑菌率达74.8%和71.8%；pH是影响抗菌活性的一个重要因素；除苹果轮纹病菌外，HTCC对其他病菌的抑菌率在加入金属离子后均增加，Mg2+、Ca2+的加入使抑菌率达100%；HTCC处理能引起菌丝体蛋白质和核酸外泄。
关键词：壳聚糖；壳聚糖季铵盐（HTCC）；抗真菌活性；机理
中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3306-04
随人们对食品安全和环境安全的重视，开发新型无毒无害的农用抗菌剂成为当前研究热点之一。壳聚糖（CTS）作为一种绿色环保抗菌剂而受到国内外持续关注和研究。壳聚糖是自然界中惟一的碱性多糖[1]，不仅来源丰富，而且具有安全无毒、生物相容性好、可生物降解、防腐抗菌[2]、无免疫源性[3]等生物学性能和制粒、拉丝、成膜[4]、吸湿保湿[5]等理化特性，被广泛应用于医药、化工、农业以及生物工程等领域[6]。但是，壳聚糖不溶于水的性质限制了其进一步应用。试验通过烷基化改性壳聚糖制得了水溶性的壳聚糖季铵盐（HTCC），采用傅立叶红外图谱（FT-IR）、氢核磁共振（1H NMR）对其结构进行表征；选取花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盘孢（Colletotrichum coccodes）4种农作物易感病原真菌作为测试菌种，研究了不同浓度、pH、金属离子条件下壳聚糖季铵盐的抗真菌性能，并初步探索其抗菌机理。
1 材料与方法
1.1 试剂
壳聚糖（脱乙酰度90%），购自天津市久康生物工程有限公司；2，3-环氧丙基三甲基氯化铵（EPTAC），购自上海笛柏化学品技术有限公司；异丙醇、乙醇、醋酸等试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。
1.2 菌种
花生尾孢菌、立枯丝核菌、苹果轮纹病菌、可可刺盘孢，河北工业大学化工学院生物工程系保藏。
1.3 HTCC的合成与表征
6 g壳聚糖（粘均相对分子质量为2×104）加入到54 mL异丙醇中，搅拌均匀，水浴加热至60 ℃，加入60 mL 370 mg/mL 的EPTAC溶液，水浴升温至80 ℃，反应10 h，离心、弃上清液，沉淀经80%异丙醇洗涤，离心，取沉淀冻干即为HTCC。HTCC用KBr压片，使用TENSOR 27型红外光谱仪（德国Bruker Optics公司）对HTCC进行红外光谱分析；使用AVANCE 400型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker Biospin公司）对HTCC进行氢核磁共振分析。
1.4 HTCC抗植物病原真菌活性测定
1.4.1 不同浓度HTCC抗真菌活性的分析 PDA培养基中加入HTCC醋酸缓冲液（pH 5.0），使培养基中HTCC终浓度依次为0.0（对照，CK）、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。培养基中央贴直径6 mm的菌饼，27 ℃培养，定时测量菌落直径，计算抑菌率（IR）。
1.4.2 pH对HTCC抗真菌活性的影响 配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0的 HTCC终浓度为0.5 mg/mL的PDA培养基，贴菌饼培养5 d，测定抑菌率。以不加HTCC的相同pH的PDA培养基为对照（CK）。
1.4.3 金属离子对HTCC抗真菌活性的影响 PDA培养基中分别加入HTCC醋酸缓冲液（pH 5.0）和K+、Na+、Ca2+、Mg2+金属离子，使金属离子终浓度为1 mmol/mL，HTCC终浓度为0.2 mg/mL。贴菌饼培养7 d，测定菌落直径，计算抑菌率。
1.4.4 抑菌率计算 抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径） × 100%。
1.5 HTCC抗植物病原真菌机理研究
取液体培养3 d的C. arachidicola菌丝4 g（湿重），用0.9%的NaCl溶液洗涤，悬浮于40 mL磷酸缓冲液（pH 7.2，含0.8 mg/mL HTCC）中，27 ℃振荡温育。定时测定280 nm和260 nm的吸光值（A）。
1.6 统计分析
所有试验均重复3次，数据处理采用SPSS软件辅助进行。
2 结果与分析
2.1 HTCC的结构特性与分析
2.1.1 FT-IR分析结果 壳聚糖在1 651 cm-1处的吸收峰为其分子中-NH2的弯曲振动峰[7]，此峰在HTCC中消失（图1），说明改性后的壳聚糖分子中的-NH2发生了改变；而HTCC在1 483、1 647 cm-1处出现两个新的吸收峰（图1），分别表示HTCC分子中季铵基团中-CH3的变形振动峰和伸缩振动峰[8]。该结果说明壳聚糖中的-NH2被烷基取代，合成了HTCC。
2.1.2 1H NMR分析结果 HTCC的氢核磁共振谱图中在δ=3.176处出现强吸收峰（图2），为HTCC分子中-N+（CH3）3上H-d的吸收峰[9]；在δ=2.720、4.498、2.502处出现了3个弱的吸收峰（图2），分别为HTCC支链上H-a、H-b、H-c的吸收峰[10]。氢核磁共振谱图进一步证实试验成功合成了HTCC。
2.2 HTCC抗植物病原真菌活性
2.2.1 不同浓度HTCC抗真菌活性 HTCC对4种病原真菌均具有一定的抑制效果，并且随HTCC浓度的增加、作用时间的延长，抑菌率均有所提高（图3）。对于C. arachidicola，当所用HTCC的浓度为0.5 mg/mL时，试验时间内最终的抑菌率达64.8%，而当HTCC的浓度为2.0 mg/mL时，最终的抑菌率高达74.8%；对于B. berengriana，当HTCC的浓度为2.0 mg/mL时，最终的抑菌率为71.8%。HTCC对R. solani、C. coccodes的抑制作用稍差，但当HTCC的浓度为2.0 mg/mL时，最终抑菌率也超过50.0%。
2.2.2 pH对HTCC抗真菌活性的影响 不同pH下HTCC对4种真菌的抗菌效果见表1。对于C. arachidicola、B. berengriana，随pH增加，HTCC抗菌性增强。Qin等[11]的研究表明HTCC对E. coli、S. aureus在弱碱环境下的抗菌性优于弱酸环境，本研究对C. arachidicola、B. berengriana试验结果趋势与之相近。对于R. solani、C. coccodes则是在pH 5.0时抑菌率较大。试验结果表明HTCC氨基组的正电荷并不是其发挥抗菌活性的惟一原因，HTCC抗菌性能可能与测试菌株自身对HTCC的敏感性及对pH的耐受程度有关系。
2.2.3 金属离子对HTCC抗真菌活性的影响 金属阳离子对HTCC抗真菌效果的影响见图4。由图4可见，金属离子的加入显著增强了HTCC对R. solani、C. coccodes、C. arachidicola的抗菌活性，尤其是二价阳离子Ca2+、Mg2+加入后HTCC的抑菌率高达100%。此外，对于R. solani、C. coccodes，在加入K+、Na+后HTCC的抑菌率也达到100%。而对于B. berengriana， K+、Na+的加入使HTCC的抑菌率不同程度地降低，Ca2+、Mg2+的加入使其抑菌率有所增加。金属离子对HTCC抗真菌活性的影响较大，适当选择添加离子，在较低浓度下可大幅提高HTCC抗植物病原真菌的性能。
2.3 HTCC抗植物真菌机理
HTCC处理C. arachidicola菌丝体后，溶液的280、260 nm吸光值都有所增加，说明引起了菌丝体蛋白质和核酸的泄露（图5）。菌丝体内容物的泄漏，推测主要是由于菌丝体细胞膜和细胞壁受到了部分破坏。真菌的细胞壁含有几丁质[12]，高浓度的壳聚糖激活了几丁质酶，进而导致真菌自身降解细胞壁，从而裸露细胞膜，抑制了真菌的生长[13]。另有研究[14]认为，壳聚糖处理R. stolonifer后造成了细胞膜上位点被破坏，形成小孔隙。此外，有文献[15，16]报道HTCC为一种聚阳离子杀菌剂，拥有正电荷，而细菌、真菌细胞表面带负电荷，二者可以形成复合物，使膜的流动性、渗透性发生改变，从而起到抑菌效果。
3 结论
试验得到了水溶性的壳聚糖季铵盐，克服了壳聚糖不溶于水的应用限制。合成的壳聚糖季铵盐在浓度为2.0 mg/mL时，对C. arachidicola、B. berengriana的抑菌率高达74.8%和71.8%，在较低浓度下添加Ca2+、Mg2+可以使HTCC对C. arachidicola、R. solani、C. coccodes的抑菌率高达100%。HTCC作为一种环境友好型抗菌剂，可以探索其在农业生产中的应用。
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