[摘要] 目的 观察高糖环境下豚鼠膀胱Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）内钙离子荧光的改变，探讨糖尿病膀胱（diabetic cystopathy，DCP）的发病机制。 方法 采用酶消化法原代培养, 激光共聚焦技术观察5、10、15 mmol/L葡萄糖浓度下培养24、72 h的ICCs，扫描记录每个时间点胞内的钙离子荧光强度值。结果 糖浓度增高培养时间延长，ICCs内钙离子荧光值升高（P ＝ 0.00），只有15 mmol/L的24 h组降低（P ＝ 0.00）。 结论 高糖环境对豚鼠膀胱ICCs电生理学造成显著影响，这种改变可能是造成DCP发病的重要原因之一。
[关键词] Cajal间质细胞；高糖环境；钙离子；糖尿病膀胱
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）02（b）-0017-02
Effect of high glucose on guinea pig bladder ICCs intracellular electrophysiology
FAN Yonghong
Department of Urology, the First People"s Hospital of Pingdingshan City in He′nan Province, Pingdingshan467000, China
[Abstract] Objective To observe a high glucose environment in guinea pig bladder of interstitial cells of Cajal (interstitial cells of Cajal, ICCs) Ca2+, in order to explore the fluorescence changes of diabetic bladder (diabetic, cystopathy, DCP) in the pathogenesis. Methods Primary culture ICCs bladder cells with collagenase digestion in vitro. Observed ICCs at different concentrations 5, 10, 15 mmol/L in 24, 72 hours times, by confocal laser scanning technology and got the calcium fluorescence titer. Results Glucose concentration increased the duration of culture, ICCs Ca2+ fluorescence values increased (P = 0.00), only 15 mmol/L in 24 hours decreased (P = 0.00). Conclusion High glucose environment on guinea pig bladder ICCs electrophysiology have a significant impact, such alterations may be one of the important reasons causing the onset of DCP.
[Key words] Cajal interstitial cells; High glucose environment; Calcium ion; Diabetic bladder
作为膀胱慢波活动的起搏器和传导者，ICCs在去除其调控和影响因素的干扰后，仍然可以发生自发性兴奋和收缩[1]。因此推测，ICCs功能的改变可能是DCP发病原因之一。而离体的Cajal间质细胞在高糖环境下变化的研究尚未见报道。本研究通过单细胞培养、荧光负载的方法来观察高糖环境对 ICCs细胞内钙信号的影响，以探索DCP发病的细胞学机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康豚鼠（新疆实验动物中心）。激光共聚焦显微镜META 510，Zeiss，胶原酶V，钙离子荧光剂Fluo-4（AM(Molecular Probes 公司)。
1.2 方法
1.2.1 单细胞培养豚鼠膀胱ICCs细胞 脱臼处死豚鼠，无菌手术取出豚鼠膀胱，取肌层并剪成碎块，胶原酶Ⅴ消化后以无糖型DMEM混合，接种于专用的共聚焦培养皿中，普通培养箱中培养，于培养24 h后再分别以含葡萄糖5、10、15 mmol/L的细胞培养液继续分别培养24、72 h。
1.2.2 荧光液的配制 取Fluo-4AM原液制成5 μmol/L的工作液。取共聚焦显培养皿中ICCs洗涤后，加入Fluo-4AM工作液孵育40 min后取出，洗去细胞外荧光剂后再加DMEM培养液，室温下避光恢复细胞活性。
1.2.3 共聚焦显微镜观察 共聚焦显微镜下，油镜头、400倍、1.3NA观察ICCs细胞。可见光下寻找ICCs，激光共聚焦以波长488 nm的光束扫描，记录每个时间点细胞内钙离子荧光值，每浓度/时间随机选20个ICCs样细胞。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16．0软件进行t检验和方差检验，荧光数据用x±s表示， P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 免疫荧光染色观察
共聚焦显微镜见膀胱ICCs不规则排列，胞体呈梭形。随糖浓度不断升高和培养时间不断增长，ICCs内钙信号荧光值增高，胞体变小。
2.2 ICCs细胞内钙信号结果
ICCs胞内钙信号荧光呈不规则的周期性细小变化。组内比较，24 h组内：10 mmol/L组、15 mmol/L组荧光值较5 mmol/L组均差异有高度统计学意义（P < 0.01）；72 h组内：10 mmol/L组、15 mmol/L组荧光值较5 mmol/L组均差异有高度统计学意义（P < 0.01）；组间比较：5 mmol/L组不同时间段胞内荧光值差异无统计学意义（P > 0.05）；不同时间段的10 mmol/L组和15 mmol/L组荧光值均差异有高度统计学意义（P < 0.01）。总体比较：72 h组钙信号荧光值明显高于24 h组（P < 0.01）。具体见表1。
3 讨论
糖尿病造成多系统病变，其最常见症状之一是糖尿病膀胱（DCP）。研究发现DCP存在神经退化，突触和神经递质改变、逼尿肌肌细胞[3]病变、多种因子、受体分布和含量异常[4]等，但仍无法合理解释DCP的发病机制。ICCs作为膀胱慢波活动的起搏器和传导者[5]并且存在于尿路全程[6-8]，为进一步研究DCP发病机制提供了新思路。
本研究应用单细胞培养法观察膀胱ICCs细胞在不同浓度糖环境中其生理学的变化。结果：生理范围内的糖浓度下，ICCs细胞内钙信号荧光值则无明显差异，而高浓度葡萄糖环境下，ICCs细胞内钙信号荧光值明显增高，且随培养时间延长变化更显著，只有15 mmol/L在24 h组钙信号荧光值有所下降。
数据结果分析显示：生理范围内的糖浓度对ICCs并无明显影响。而10 mmol/L组钙信号荧光明显增强，推测是高浓度的糖刺激ICCs，使其胞内超微结构发生改变，比如内质大量网扩张、线粒体广泛肿胀、胞质内大量空泡形成等，刺激ICCs细胞使其生理功能进而发生代偿而增强。而过高的浓度（15 mmol/L组）24 h钙信号荧光值下降，而72 h后又增高，推测可能是浓度过高的葡萄糖短时间内对ICCs的生理功能是抑制的，但培养时间增长，其细胞功能恢复并进一步代偿，致其胞内钙信号增强。培养24 h和72 h，10 mmol/L组荧光值均高于15 mmol/L组，提示ICCs的代偿能力与其内环境中葡萄糖浓度呈负相关，即糖浓度越高其钙信号越低。可能是过高浓度的葡萄糖持续破坏，使其内的线粒体广泛发生肿胀及至空泡样改变，甚者大量坏死溶解，粗面内质网也同时发生脱颗粒，内质网广泛扩张，胞质内也大量出现溶解坏死等现象，从而导致ICCs细胞的代偿功能下降，生理功能发生异常。
研究结果显示，ICCs功能变化与葡萄糖环境有关，葡萄糖浓度高及（或）影响时间长，则其功能变化就更明显。糖浓度高直接导致ICCs内重要结构破坏，进而使该细胞的起搏及神经与肌细胞间链接中介的结构、功能发生改变，造成膀胱自身的自发兴奋功能改变，致使膀胱逼尿肌的活动功能发生异常，而导致临床上DCP病症发生。ICCs细胞的生理功能异常改变有可能是临床发生DCP的病理基础之一。
[参考文献]
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[3] Mumtaz FH，Shukla N，Sullivan ME，et al. Inhibition of diabetic bladder smooth muscle cell proliferation by endothelin receptor antagonists[J]. Urol Res，2000，28（4）：254-259.
[4] Asano T，Saito Y，Kawakami M，et al. Clinical Pharmacology Study Group Erythrocytic sorbitol contents in diabetic patients correlate with blood aldose reductase protein contents and plasma glucose level，and are normalized by the potent aldose reductase inhibitor fidarestat（SNK-860）[J]. Diabetes Comp lications，2004，18（6）：336-342.
[5] Andersson KE，Arner A. Urinary bladder contraction and relaxation;physiology and pathophysiology[J]. Physiol Rev，2004，84：935-986.
[6] Davidson RA，Mc Closkey KD. Morphology and localization of interstitial cells in the guinea pig bladder:structural relationships with smooth muscle and neurons[J]. J Urol，2005，173（4）：1385-1390.
[7] Mc Closkey KD，Gurney AM. Kit positive cells in the guinea pig bladder[J]. J Urol， 2002，168（2）：832-836.
[8] Exintaris B，Klemm MF，Lang RJ. Spontaneous slow wave and ontractile activity of the guinea pig prostate[J]. J Urol，2002，168（1）：315-322.
（收稿日期：2011-11-22）
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