摘要 金属硫蛋白（MT）是一种普遍存在、富含金属和半胱氨酸的低分子量蛋白质，主要包括Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等硫蛋白，MT具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。ELISA以其灵敏度高、特异性强且测定相对迅速、方便、无需特殊昂贵的仪器设备、无放射性同位素的污染等特点成为MT定量检测的理想方法。MT在与金属有关的动物机体的生理学研究、某些微量元素营养性缺乏症的诊断、治疗以及保护环境等方面起着重要作用，随着对MT研究的日益深入，不断对ELISA方法的改进，利用ELISA检测MT有着广阔的前景。
关键词金属硫蛋白；检测方法；应用
金属硫蛋白（Metallothionein）是一类富含半胱氨酸残基和金属的小分子蛋白质物质，简称MT，又叫金属硫氨酸甲基内盐。主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中，因动物的不同，其分布和半衰期略有差异[1]。其研究和开发涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域[2]。
1MT的一般性质
根据与MT结合的金属种类、摩尔含量来分别命名，如Cd-MT、Cu-MT或Cd7-MT、Zn7-MT（表示每个分子中结合7个原子Cd或Zn）或Cd、Zn-MT这类形式。也可用罗马数字和小写字母标出分子结构的差别，如人MT-Ⅰb、MT-Ⅱa等。MT的三级结构由α结构域（羧基末端后30个氨基酸残基）和β结构域（氨基末端前30个氨基酸残基）构成，分子呈哑铃形。每个区域有4个Cys巯基结合金属原子。等电点PI一般在4左右。分子量范围较大，为2 000～13 800Da，其中哺乳动物的MT分子量为6 000～7 000Da。分子中不含芳香族氨基酸，没有280nm的吸收峰，与不同金属结合产生不同特征吸收峰，脱掉金属后，硫蛋白在190nm处有一明显的肽键吸收峰。
MT的金属具有动力学不稳定性，巯基具有亲核性，决定了MT易与某些亲电物质特别是某些自由基相互作用，消除辐射形成的·OH自由基。MT具有抗应激作用，如动物注射糖皮质激素、干扰素、白细胞介素－Ⅰ后，肝脏中的MT合成增加；各种炎症因子及机体的应激状态（如寒冷、过度疲劳、饥饿等）都增加MTmRNA的转录。并且MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突作用[3]。重金属（Cd、Zn等）可使MT合成速率增加，可防止Zn和Cu、Hg中毒。但MT并不是对所有能诱导它合成的金属都具有解毒作用，如Ag、Au、Co和Ni都能诱导MT的合成，却不对这些金属有解毒作用。另外在细胞内，Cd-MT具有保护作用，但在细胞外，Cd-MT具有比Cd2+本身更大的肾细胞毒性[4]。
2MT的检测方法
对MT检测方法的研究已有多年，其检测方法大多是建立在MT的理化特性和免疫学特性基础上的。
2.1免疫法
正常人血清、尿的MT含量为0.01～1.00ng/mL，一般不超过2.0～10.0ng/mL，MT量如此低微，很多方法均无法满足检测要求，免疫法具有灵敏、特异的优点，故近年来学者们尝试建立放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA），以用于MT的定量检测。
2.1.1放射免疫分析法（RIA）。1979年，Mallie等首先建立RIA，用来检测大鼠MT。随后Mulder等于1990年，利用人MT（没有注明MT的亚型）建立测定人体液MT含量的RIA，并发现抗体来源和特性不同，所呈现的结果也不同，体现了高度特异性的优点。但该法由于使用的放射性同位素，具有放射性污染，且在测量时需昂贵专用仪器，测定成本较高。
2.1.2酶联免疫吸附法（ELISA）。1986年，Thomas等建立的荧光ELISA的灵敏度与RIA相似，但在测定血清中的MT时，ELISA受血清蛋白的干扰，其灵敏度有所下降。Akintola等（1995）建立了测定人血浆和尿液中MT含量的ELISA法，其灵敏度达5.0ng/mL[5]。Van等发现抗体的特异性与MT所含的金属离子种类有关，所建立的ELISA可检测出60pg的人胎肝MT[6]。还有学者通过合成某一段特异的肽链，免疫动物制备表位特异性抗体建立ELISA来检测不同亚型的MT[7]。郑军恒、茹刚等人（1999）发现用直接ELISA方法可检测较纯的样品，竞争型ELISA方法可测定较粗的样品中MT的含量[8]。张亨山、赵金恒等（2000）组建的双抗体夹心ELISA的灵敏度为20.0ng/mL，用于测定人体MT也有较好的灵敏性和可靠性[9]。黄波等（2000）引入生物素－亲和素系统建立的竞争型ELISA，测定人尿MT，灵敏度达到2.5ng/mL，比夹心ELISA（20.0ng/mL）和ELISA－线性伏安法（5.0ng/mL）要低，且该法具有较好的精密度和准确度[10]。笔者（2004）利用纯化好的IgG建立了ELISA，灵敏度达4.1 ng/mL，并在实际应用中有较好的稳定性[11]。虽然离大幅度的推广应用还有一定的距离，但该方法特异性高，测定相对迅速，无需昂贵的仪器设备，避免接触放射性同位素，具有能大幅度提高灵敏度的潜力等优势是现采用多数测定MT的方法所不能比拟的。
2.2其他测定方法
1973年，Piotrowski等首先建立了金属结合法（203Hg/TCA法）（Mental-Binding Assay）用于测定组织中的MT。该法适于用酸沉淀其他蛋白，将MT分离出来后的测定，此法Hg的加入量极其重要，加入量过多或过少，均会导致结果偏高或偏低。鉴此，利用层析技术去除过量加入的203Hg来改良，可检测出1.0×10-3moL/L的MT。后来有人利用血红蛋白与Cd2+能稳定结合的特性去除加入的过量109Cd，然后通过检测样品中与MT结合的Cd2+含量而对MT定量，该法的检测下限为0.8μgMT/g组织，但不能用于Bi、Hg、Ag、Cu-MT样品的测定[12]。将RIA与经典的109Cd/hen法作比较，得知RIA适于测定MT含量低的样品，镉饱和法适合测定MT含量较高的样品[13]。
利用高效液相色谱法（HPLC）将Cd诱导大鼠的肝脏中的MT分离出来，直接联于AAS后，检测样品中金属含量，达到对MT定量检测的目的。该方法可在1h内检出浓度小于1μg/mL的1mL上柱样品中的MT含量，并可分别测定不同型的MT。逆相高效液相色谱法（RP-HPLC）最适于对MT同分异构体的研究。此外，还可利用HPLC分离MT后，根据样品对150nm紫外光吸收特性来直接对MT定量，与经典Cd饱和法的测定结果相符[14]。
示差脉冲极谱法（OPP）是利用巯基在汞滴电极表面产生氧化还原反应后，出现电位变化而测定MT。此法的检测限为1.0×10-8moL/L，不受MT分子中金属含量的影响，但受到其他种含巯基蛋白的干扰，故在测定之前必须先去除杂蛋白[15]。该法测定动植物组织中MT含量，结果优于镉饱和法，而且特别适合于新的动植物体提取由复杂因素诱导合成的MT或类似蛋白[16]，但所需设备特殊。
3MT检测的影响因素
首先，大量的非MT蛋白和非MT蛋白/MT的值较高会影响MT的检测。如在免疫法中抗体非特异性地与非MT蛋白结合；非MT蛋白与MT的高比率会影响色谱法的检测结果，而金属饱和法则受非MT蛋白的影响较小。所有这些方法可能会受到热酸等稳定的低分子量巯基影响。其次，生物体内MT同分异构体的存在也会影响MT免疫分析的检测结果，这主要是由于MT同分异构体对抗体不同的抗原性所致。再次，金属与MT的结合也是选择MT检测方法时应该考虑的一个因素，因为MT的金属组成会影响MT的稳定性及对氧化作用的灵敏度。例如，检测Cu-MT的样品应避免加热，免疫法受MT氧化作用的影响比其他方法要小。
4ELISA的步骤
4.1抗原和抗血清的制备
先将100mgMT、200mg牛血清白蛋白（BSA）在20mL的PBS（0.1moL/L，pH值7.0）中溶解并混合均匀，然后在振荡条件下滴加20mmoL/L戊二醛（GDA）10mL在25～30℃反应2h，形成鲜黄色偶联物，放入冰箱过夜，次日即可使用 [11]。与弗氏佐剂乳化后，对免疫动物进入皮下或皮内注射，直至其抗血清效价大于1∶16时即可采血。采血后，全血放入4℃过夜，待血清充分析出，4 000r/min离心取上清液，加0.02%叠氮化钠（NaN3）防腐，-40℃保存备用。
4.2分析步骤
（1）包被：加含标准样品的包被液100μL，4℃包被过夜。洗涤4次。
（2）封闭：每孔加封闭液200μL，37℃封闭2h。洗涤4次。
（3）加一抗：将待测样品及稀释好的抗血清（含MT的高效价抗体）等量混合均匀后于每孔中加入100μL，37℃反应2～3h。洗涤4次。
（4）加酶标二抗：加稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗（sigma公司）100μL/孔，37℃反应2h。洗涤4次。
（5）加底物：加TMB底物100μL/孔，37℃反应20～30 min。
（6）加终止液：加2moL/L的H2SO4 50μL。
（7）在酶标仪450nm波长读数[11]。
（8）根据标准曲线计算出MT含量。
5MT的ELISA法的应用
5.1 环境监测
人和环境关系密切，重金属污染环境，动植物体内金属含量必定异常，MT可作为检测重金属污染的指标，如鱼组织（尤其是肝、肾）MT含量可以作为反映水域中重金属污染情况的指标来研究[17]。同时，通过测量血浆或尿MT浓度可以检测重金属中毒的情况。国外已有职业接触Cd者尿中Cd-MT测定的报道，认为MT浓度与体内金属浓度有较好的相关性，利用检测MT来取代检测血和尿中金属来反映人体中毒更为合适。
5.2动物生理学研究
MT广泛地存在于生物界，并参与了各种代谢过程，具有非常重要的生理和生物学功能。MT在体内的代谢受多种因素的影响，包括年龄、种属、营养状况、肝功能等，参与动物机体多种微量元素的储存、运输和代谢，如MT调节小肠中Cu和Zn的交换速度[3]，可以作为研究高Cu、高Zn以及非金属元素Se在动物体内的各种作用机理的突破点[18]。对尿液、血浆和细胞中MT的分析可用于营养状态的评估，特别是Zn缺乏的诊断；还可以用于研究家畜、家禽在高密度的饲养条件下或长途运输过程中的生理状况。因此，MT的ELISA法的建立为研究MT对动物机体的生理作用或相关机制提供了一个较为有效、方便的手段。
5.3在医学上的应用
MT涉及许多生理和病理学过程，在医学上的应用研究主要有[19]：
（1）与Cu代谢有关的疾病。如：Menk’s病（与Cu代谢的MT基因调控失灵有关）和Wilson’s（先天性铜蓄积症）。
（2）与肿瘤有关的研究。可增强某些抗肿瘤药物（如顺铂、阿霉素等）的作用，同时有效地减轻它们同时使用时所产生的毒性作用。MT的表达量与细胞对顺铂的抗药性作用成正比。
（3）胃溃疡。MT-Ⅰ可加强抗溃疡屏障系统的形成和作用。
（4）辐射治疗。能有效地抗自由基，作为辐射治疗的一种辅助手段。
（5）Alzheimer’s病的治疗。Alzheimer’s病（简称AD症）是一种人类常见的老年性痴呆症，当研究AD症的发病机理时，发现了一种MT类蛋白生长抑制因子（简称GIF）。
我们相信，随着对MT的生理、病理作用及其机理研究的日益深入，MT的ELISA法作为一种灵敏特异的检测方法，能在现有的基础上逐步提高灵敏度、准确性，其应用前景将是十分广阔的。
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