材料与方法
1.1主要材料 人胃腺癌细胞AGS购自美国模式培养物存库（American type culture collection，ATCC），RORα激动剂SR1001购于美国Cayman公司（规格：1 mg货号：10922），胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，F12培养基购自Hyclone公司，小鼠抗人单克隆抗体β-actin 购自美国Santa Cruz 公司，蛋白裂解液（Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1% SDS，5 mg/ml Leupeptin，1 mmol/L PMSF），MTT细胞凋亡试剂盒購自Beyotime公司。
1.2细胞培养 AGS培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素及链霉素）的F12培养基中，培养条件为37℃，5%CO2、饱和湿度，每2 d更换1次培养基，并种植于6孔板中，细胞密度为1×106/2 ml。根据处理浓度不同分组，将以1 μmol/L的SR001处理的设为1 μmol/L浓度组，将以0.1 μmol/L的SR001处理的设为0.1 μmol/L浓度组;另设溶媒组及对照组，分别给予等量的溶媒、等量的喜树碱（50 μmol/L）。
1.3 MTT试剂盒检测RORα对胃癌细胞凋亡的影响 取经培养好的AGS，消化后进行细胞浓度检测，并用培养基调整至5000 个/100μl;加入96孔板中，SR1001 1 μmol/L浓度组，0.1 μmol/L浓度组及溶媒组每孔加入10 μl的5-FU（10 μg/ml），对照组每孔加入对照药物（50 μmol/L喜树碱），PBS封闭周围一圈，每孔加入10 μl配制好的MTT溶液，轻轻混匀，培养箱中孵育4 h后取出，再给予每孔加入100 μl试剂盒中的Formazen溶解液，轻柔混匀继续放置培养箱中孵育4 h，使用普通光学显微镜下观察，当紫色结晶全部溶解后，采用酶标仪在570 nm测定吸光度值，以上实验重复3次。
1.4 Western blot检测蛋白表达 根据不同的处理方法将AGS细胞分组，分别为SR1001 1 μmol/L浓度组，0.1 μmol/L浓度组及溶媒组。细胞处理24h后用PBS 洗3遍，用细胞刮刮下培养瓶中的细胞，并用移液枪把液体吸到标记好的1.5 ml EP管中，每瓶加入蛋白裂解液100 μl，放置于冰上裂解30 min，每10 min振荡混匀1次，4 ℃高速冷冻离心机以14000 r/min离心30 min吸取上清液，加入蛋白上样缓冲液，充分混匀，于沸水中煮沸10 min后置-80℃保存。根据BCA蛋白定量，每组取含有等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h 后，用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍，分别加入Caspase-3、β-actin抗体4℃孵育过夜，再用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，TBS洗膜3次，ECL发光试剂盒显影。用软件image J测定各条带的灰度值，以β-actin 为参照，计算相对条带的灰度值。以上实验重复3次。
1.5观察指标 观察MTT检测化疗药物5-FU介导的细胞凋亡情况，AGS细胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表达及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比较。
1.6统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料使用（x±s）表示，采用单因素方差分析（oneway-ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 RORα激动剂对AGS细胞中RORα磷酸化的影响 采用Western blot检测细胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表达结果显示，与溶媒组比较，SR1001可以增强AGS细胞中p-RORα蛋白的表达，见图1A，并采用image J检测相关条带的灰度值的相对百分比，其差异有统计学意义（P<0.05），见图1B。
2.2 RORα激动剂对5-Fu介导的细胞凋亡率的影响 RORα激动剂处理显著增加5-FU介导的AGS细胞凋亡，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
2.3 RORα对细胞中凋亡蛋白的影响 RORα激动剂处理后cleaved caspase-3水平增加，见图3A。 ImageJ软件测量图3A中 cleaved caspase-3条带的灰度值并计算其相对于溶媒组的百分比，其差异有统计学意义（P<0.05），见图3B。
3讨论
RORs是核受体的一个家族，是细胞内转录因子的一员。RORs 包括RORα（NR1F1）， RORβ（NR1F2）及RORγ（NR1F3）三个成员，RORα最早于上世纪九十年代被发现，因结构与维甲酸受体及维甲类X受体相似而得名[4]，之后RORβ和RORγ被依次发现。RORα、RORβ及 RORγ在不同种属及不同组织中表达不同，RORα广泛分布于肝脏、骨骼肌、皮肤、脂肪组织、肾脏、胸腺及脑组织中，RORα有α1、α2、α3、α4四种亚型，在鼠类中仅存在α1和α4两种亚型[5，6];RORβ有β1，β2两种亚型，只有β1亚型存在人类中，RORβ的表达与神经系统相关，分布于脑及视网膜。RORγ有γ1，γ2两种亚型，分布于免疫系统，RORγ2高度表达于胸腺组织，故也常被称为RORγt。RORs能识别特定的DNA序列（通常由TAAA/ TNTAGGTCA组成），即ROR反应元件（RORE），作为单体与之结合，而不像大多数受体以二聚体形式结合，这也是其被称为孤儿受体的原因。
RORα广泛分布于组织中，被称为生物节律，脂质代谢和免疫炎症反应的调节剂。研究表明RORα可能在癌症发展中起作用，肿瘤微环境在结直肠癌中至关重要。RORα抑制结肠直肠癌细胞增殖，迁移和诱导血管生成，是通过影响脂肪细胞的方式来介导[7]，有研究表明，与癌旁组织相比，在肝癌细胞中存在RORα低表达的情况，并且这种表达与肿瘤的临床病理特征有相关性，低RORα表达的肝癌患者具有较高的AFP水平，较差的病理学分级，肿瘤复发和血管侵入的倾向。然而，在RORα表达与年龄，性别，乙型肝炎血清抗原（HBsAg）状态，肿瘤大小或肝硬化之间未观察到统计学上显着的相关性。此外，RORα与肿瘤患者预后有关，低RORα表达的患者具有比高表达的患者总体生存率更低，无病生存时间更短[8]。
有研究显示RORα参与前列腺素介导的Wnt信号传导，并且似乎更像是是中心分子开关[9，10]。在肝细胞肝癌中，约65%的患者存在RORα低表达，且其总体生存率和无病生存时间更短[8]，另外RORα高表达可抑制胃癌细胞MGC803细胞增殖与迁移侵袭，将细胞阻滞于G2/M期，其机制可能与下调MMP-9和上调TIMP3有关[11]。本研究中采用RORα激动剂SR1001来提高RORα的磷酸化，并采用MTT试剂盒检测其对细胞凋亡的影响发现，相对于溶媒组，提高RORα的磷酸化后，5-FU介导的细胞凋亡率增加，并且相关凋亡蛋白含量增高，表明RORα可以增加5-FU介导的胃癌细胞的凋亡。
综上所述，RORα可以增加5-FU介导的胃癌细胞的凋亡，具有作为5-FU化疗药物的增敏剂的潜质，为研发新型的化疗药物或增敏剂提供新的思路。
参考文献：
[1]The Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J].Nature，2014，513（7517）：202-209.
[2]季加孚.我国胃癌防治研究三十年回顾[J].中国肿瘤临床，2013，40（22）：1345-1351.
[3]王小山，祁义军，俞浩远，等.RORα与REV-ERBα在人胃癌组织表达情况及其临床意义[J].安徽医科大学学报，2018，53（3）：411-415.
[4]Kadiri S，Monnier C，Ganbold M，et al.The nuclear retinoid-related orphan receptor-α regulates adipose tissue glyceroneogenesis in addition to hepatic gluconeogenesis[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2015，309（2）：E105-E114.
[5]Li H，Zhou L，Dai J.Retinoic acid receptor-related orphan receptor RORα regulates differentiation and survival of keratinocytes during hypoxia[J].J Cell Physiol，2018，233（1）：641-650.
[6]Steinmayr M，Andre E，Conquet F，et al.staggerer phenotype in retinoid-related orphan receptor alpha-deficient mice[J].Proc Natl Acad USA，1998，95（7）：3960-3965.
[7]Xiao L，Wang J，Li J，et al.RORα inhibits adipocyte-conditioned medium-induced colorectal cancer cell proliferation and migration and chick embryo chorioallantoic membrane angiopoiesis. [J].Am J Physiol Cell Physiol，2015，308（5）：C385-C396.
[8]Fu RD，Qiu CH，Chen HA，et al.Retinoic acid receptor-related receptor alpha（RORalpha）is a prognostic marker for hepatocellular carcinoma[J].Tumor Biol，2014，35（8）：7603-7610.
[9]Berman AY，Manna S，Schwartz NS，et al.ERRα regulates the growth of triple-negative breast cancer cells via S6K1-dependent mechanism[J].Signal Transduct Target Ther，2017（2）：e17035
[10]Shin D，Kim IS，Lee JM，et al.The hidden switches underlying RORα-mediated circuits that critically regulate uncontrolled cell proliferation[J].J Mol Cell Biol，2014，6（4）：338-348.
[11]趙晓红，刘芳，向姝霖，等.RORα高表达对人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响[J].肿瘤防治研究，2016，43（11）：926-932.
收稿日期：2019-5-25;修回日期：2019-7-3
编辑/肖婷婷
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